[發明專利]一種用于檢測赭曲霉毒素的熒光偏振免疫分析方法

在審

• 申請號: 201810177258.7
• 申請日: 2018-03-05
• 公開（公告）號: CN108362882A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 楊博易
• 申請（專利權）人: 楊博易
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 北京彭麗芳知識產權代理有限公司 11407
• 代理人: 彭麗芳

本發明公開了一種用于檢測赭曲霉毒素的熒光偏振免疫分析方法，包括以下步驟：S1、將一系列已知濃度的赭曲霉毒素標準品的溶液分別與熒光標記物溶液、赭曲霉毒素單克隆抗體溶液混合，孵育進行競爭反應，測定所得體系的熒光偏振值；S2、以測定的熒光偏振值為縱坐標，一系列已知濃度的赭曲霉毒素標準品的濃度為橫坐標，繪制標準曲線；S3、以待測樣品代替步驟S1中的赭曲霉毒素標準品，將待測樣品與熒光標記物溶液以及赭曲霉毒素單克隆抗體溶液混合，孵育進行競爭反應，測定所得體系的熒光偏振值；S4、根據步驟S2中的標準曲線，計算出待測樣品中赭曲霉毒素的濃度。本發明整個檢測過程只需要一步競爭反應，操作簡單、快速。

技術領域

本發明涉及免疫分析技術和真菌毒素檢測領域，具體涉及一種用于檢測赭曲霉毒素的熒光偏振免疫分析方法。

背景技術

赭曲霉毒素(ochratoxin)主要是由赭曲霉屬(Aspergillus ochraceus)和青霉屬(Pecillium)真菌產生，主要分為赭曲霉毒素A、B、C三種類型。其中，赭曲霉毒素A毒性最大，廣泛污染農產品和食品。因此其在動物體內容易蓄積，具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性、細胞毒性、致畸、致癌等，被OARC列為2B類致癌物。GB2761-2011食品安全國家標準食品中明確規定了OTA在谷物及其制品中的最大殘留限量(Maximum Residue Limit，MRL)為5ng/mL，豆類及其制品中為5ng/mL。

目前，赭曲霉毒素殘留的檢測方法主要有生物鑒定法、化學分析法和儀器分析法。其中儀器分析法主要為高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、高效液相色譜-質譜聯用法等，由于其準確度高、重現性好多為國標所采用。但是需要依賴于昂貴的儀器設備，分析成本高且對檢測環境和操作人員均有較高要求，難以滿足現場快速檢測需求。

發明內容

針對植物蛋白中赭曲霉毒素免疫檢測技術中，假陽性高、靈敏度低等缺點，本發明提供了一種用于檢測赭曲霉毒素的熒光偏振免疫分析方法，整個檢測過程只需要一步競爭反應，操作簡單、快速。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

一種用于檢測赭曲霉毒素的熒光偏振免疫分析方法，包括以下步驟：

S1、將一系列已知濃度的赭曲霉毒素標準品的溶液分別與熒光標記物溶液以及赭曲霉毒素單克隆抗體溶液混合，孵育進行競爭反應，測定所得體系的熒光偏振值；

S2、以測定的熒光偏振值為縱坐標，所述一系列已知濃度的赭曲霉毒素標準品的濃度為橫坐標，繪制標準曲線；

S3、以待測樣品代替步驟S1中的赭曲霉毒素標準品，將所述待測樣品與所述熒光標記物溶液以及所述赭曲霉毒素單克隆抗體溶液混合，孵育進行競爭反應，測定所得體系的熒光偏振值；

S4、根據步驟S2中的標準曲線，計算出所述待測樣品中赭曲霉毒素的濃度。

優選地，所述步驟S21中的熒光標記物為改造后赭曲霉毒素半抗原(6-[[(1-naphthyloxy)carbonyl]amino]hexanoic acid，CNH)與熒光素的偶聯物。

優選地，所述熒光素選自下述任意一種：4-氨甲基熒光素(AMF)，異硫氰酸熒光素乙二胺(EDF)，異硫氰酸熒光素丁二胺(BDF)，異硫氰酸熒光素己二胺(HDF)。

優選地，步驟S1中所述一系列已知濃度的赭曲霉毒素標準品的溶液的溶質為赭曲霉毒素標準品，濃度分別為0，0.01，0.03，0.1，0.3，1，10ng/mL，溶劑為含10％甲醇的硼酸鹽緩沖液。

該硼酸鹽緩沖液的pH值為8.5，通過以下步驟制備所得：

稱取0.47mg Na₂B₄O7，0.05mg NaN₃溶解于0.5mL高純水中，即得。