[發明專利]檢測食品中產氣莢膜梭菌和NetB基因的引物、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201810176237.3
• 申請日: 2018-03-02
• 公開（公告）號: CN108456739A
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 張憲臣;邱德義;吳冰;王勇
• 申請（專利權）人: 中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/145
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司 44345
• 代理人: 吳劍鋒

1.一種檢測食品中產氣莢膜梭菌及NetB基因的引物，其特征在于該引物和探針組合的序列分別為：

上游引物recAF:tgggagattctcacgttggtc

下游引物recAR:gcttgcttaaatggaggagca

探針recAP:acaacaccaggtggtagagcgt

上游引物NetBF：acggaaaaatgaaatggcctga

下游引物NetBR：tcgccattgagtagtttccca

探針NetBP：aggaaaaactgctggtgctggaa。

2.一種檢測食品中產氣莢膜梭菌及NetB基因的試劑盒，其特征在于該試劑盒中20.0μL反應體系包括以下組分：2×ddPCR Super Mix 10.0μL，上、下游引物各1.0μL、探針各1.0μL，DNA模板4.0μL。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的上游引物recAF與上游引物NetBF的含量比例為0.1-1:1。

4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于所述的下游引物recAR與下游引物NetBR的含量比例為0.1-1:1。

5.一種檢測食品中產氣莢膜梭菌及NetB基因的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、提取樣品DNA；

B、將各反應組分加入如權利要求2所述的20.0μl反應體系，然后加入70.0μl礦物油，混勻后轉移到微滴發生器上自動產生微滴；同時分別取所述試劑盒中的陽性質控、和陰性質控，按照與步驟A相同的方法處理，得到相應的DNA模板；

C、將制備數字PCR混合液制作為油包水PCR微反應,并全部轉移到96孔反應板PCR反應管中；再將96孔反應板在封膜儀上封膜，并置于普通PCR儀進行PCR反應。

D、打開微滴熒光檢測器應用軟件，將PCR反應結束后的96孔反應板直接插入設備，檢測每PCR反應管中微滴的PCR反應情況,最后根據珀松分布定律算出待測基因的拷貝數。

6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于步驟C中PCR擴增的反應程序按以下步驟進行：

(1)94℃預變性3min；

(2)94℃變性10s，57.5℃退火1min，共進行40個循環；

(3)98℃酶熱失活10min；

(4)4℃停止反應。

7.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于步驟A中所述的提取樣品DNA：挑取經可疑的單個菌落,加入200μl滅菌重蒸水中,制備產氣莢膜梭菌菌懸液,將其置于干式恒溫器上100℃加熱20min,然后于12000r/min離心10min,取上清液分裝Eppendorf管,作為擴增反應的DNA粗制模板，溶解于50μL的TE溶液中。