[發明專利]基于雙分子熒光互補的新型細胞微絲骨架標記方法

在審

• 申請號: 201810171905.3
• 申請日: 2018-03-01
• 公開（公告）號: CN108267435A
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 張宏晨;邵世鵬
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11360
• 代理人: 蘇愛華

細胞骨架蛋白在細胞的生命活動中起到非常重要的支撐作用，是細胞運動和分裂的基礎。對于微絲骨架的標記和長時間觀察可以獲得細胞微絲骨架的亞細胞分布和動態行為，幫助我們理解微絲骨架的結構和功能。現存的各種標記方法無法同時實現活細胞、高分辨、長時程、無侵入、高特異、高穩定等特點，限制了其在活細胞微絲骨架標記和追蹤中的應用。本發明使用一種基于雙分子熒光互補的新型細胞微絲骨架標記方法，利用微絲骨架結合短肽LifeAct融合分裂的蛋白，在該融合蛋白不結合纖維狀微絲骨架時不發熒光，在其結合時發光，實現活細胞內無熒光背景的微絲蛋白的標記和成像。新的微絲骨架的標記方法在正常以及病理和藥理條件下哺乳動物細胞中有著廣泛的應用。

技術領域

本發明涉及一種新的細胞內微絲骨架F-actin的探針開發和標記方法，及其在細胞生物學和細胞力學中的應用。屬于細胞生物學領域。

背景技術

哺乳細胞中含有大量的細胞骨架蛋白用以支撐細胞的剛性結構。細胞各種生命活動的進行離不開細胞骨架的支持作用。細胞骨架是由豐富的蛋白纖維網絡結構構成，貫穿細胞的每一個角落，不僅在維持細胞形態，承受外力、保持細胞內部結構的有序性方面起重要作用，而且還參與許多重要的生命活動。如:在細胞分裂中細胞骨架牽引姐妹染色單體的分離，在細胞物質運輸中，各類囊泡和細胞器可沿著細胞骨架定向轉運，細胞外基質刺激細胞的信號傳遞。在肌肉細胞中，細胞骨架和它的結合蛋白組成動力系統。在白細胞的遷移、精子的游動、神經細胞軸突和樹突的伸展等方面都與細胞骨架有關。另外，在植物細胞中細胞骨架還可以指導細胞壁的合成。細胞骨架主要包括微管，微絲和中間纖維，廣義的細胞骨架還包括核基質、核纖層和細胞外基質，形成貫穿于細胞核、細胞質、細胞外的一體化網絡結構。細胞在病理情況下常常會出現細胞骨架系統異常。微管減少、解聚、細胞骨架異常等可增強癌細胞的運動能力，會導致腫瘤的惡性轉移和轉化。在腦神經元中有大量扭曲變形的微管和大量受損的中間纖維，則會導致阿爾茨海默癥。微絲束及其末端黏著斑的破壞以及肌動蛋白小體的形成，常常伴隨腫瘤細胞的浸潤和轉移。此外，中間纖維的分布具有嚴格的組織特異性，絕大多數腫瘤細胞在發生轉移后仍表現其原發腫瘤的中間纖維類型，可用來輔助判斷腫瘤類型。

微絲是細胞骨架的一種，普遍存在于所有真核細胞中，是一個實心狀的纖維，直徑為4nm-7nm。一般細胞中含量約占細胞內總蛋白質的1％-2％，但在活動較強的細胞中可占20％-30％。微絲具有多種功能，在不同細胞中表現不同，在肌細胞組成粗肌絲、細肌絲，可以收縮，在非肌細胞中主要起支撐作用、非肌性運動和信息傳導作用。微絲主要由肌動蛋白(actin)構成，和分子馬達蛋白肌球蛋白(myosin)一起作用，使細胞運動。它們參與細胞的變形蟲運動、植物細胞的細胞質流動與肌肉細胞的收縮等細胞生物學過程。

雖然細胞骨架是剛性的結構，但是并不表示細胞骨架是一成不變的。相反，細胞骨架同時是一個高度動態的結構，在細胞生命活動中，細胞骨架必須不斷的重塑，聚合，解聚才能正常的發揮功能。細胞內的微絲蛋白主要以兩種形式存在，單體化(G-actin)和聚合化(F-actin)。這兩種形式的比例在時間和空間上被一系列信號轉導蛋白高度調控，以適應細胞在不同條件下的生命活動的需要。所以發展活細胞細胞微絲骨架的標記技術和方法對理解細胞骨架的結構和功能的關系非常重要。