[發明專利]用于進行實時數字PCR的方法和裝置

在審

• 申請號: 201810171856.3
• 申請日: 2018-03-01
• 公開（公告）號: CN108373971A
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發明（設計）人: 王焱
• 申請（專利權）人: 南京科維思生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12M1/38
• 分類號: C12M1/38;C12M1/34;C12Q1/6851
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 楊文晰

本發明公開了一種可以進行多個獨立的數字PCR并具有實時監測能力的裝置。所述裝置包括多個與其自身的溫度控制元件熱耦合的PCR微型反應器、檢測單元、以及用于容納和移動所述PCR微型反應器的電動平臺。所述實時數字PCR裝置可以同時進行多個數字PCR，生成數以千萬計的單獨PCR過程的擴增曲線，基于所述擴增曲線評估二進制讀數，并且基于所述擴增曲線識別不同的靶序列。本發明還公開了使用所述實時數字PCR裝置以檢測靶核酸和對循環腫瘤細胞進行計數的方法。

相關申請的交叉引用

本申請要求于2017年3月5日提交的美國臨時專利申請第62/470,211 號以及于2018年2月22日提交的美國專利申請第15/901,900號的權益，所述臨時專利申請的內容以參考的方式并入本文中。

技術領域

本發明涉及用于檢測靶核酸或靶細胞的方法和裝置，具體涉及采用實時數字PCR以檢測靶核酸和靶細胞的方法和裝置。

背景技術

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種使用DNA聚合酶和DNA聚合反應以使特定核苷酸產生數以千萬計的拷貝數的方法。通常它經歷不同溫度下的熱循環使之可重復地進行雙鏈DNA變性、靶DNA序列引物退火、以及延伸引物以生成靶序列的拷貝。PCR是分子生物學中不可或缺的技術，其廣泛應用于檢測、鑒定、獲得和定量目的DNA/RNA序列。

定量PCR，也稱之為實時qPCR，是一種在PCR擴增循環中通過監測靶序列的生成來量化靶序列的量的技術。通過非特異性熒光染料或者通過序列特異性DNA探針實時地監測靶序列的生產量，其中該非特異性熒光染料因嵌入雙鏈DNAs上而產生熒光，而該序列特異性DNA探針一旦雜化至互補序列上就會發出可檢測的熒光信號。在qPCR過程中，該基于DNA的熒光值可以在PCR循環中的任意時間測量。靶序列的量通過計算Ct值來確定，C_t是當被檢測到的熒光水平超過閾值(顯著高于背景噪音水平) 時的循環數閾值。通過比較來自于靶序列的RNA/DNA的C_t與來自相同樣品的管家參考基因的RNA/DNA的C_t，可以確定基因表達的相對量。絕對量是很難獲得的，通常是與已知的DNA稀釋法構建的標準曲線相比對而得到。諸如PCR擴增效率的變化和非指數擴增這些因素可以影響定量結果的準確性，并且限制了其辨別基因數量小倍數差異的能力。

數字PCR(dPCR)是PCR技術的改進，實現了對核酸鏈的絕對定量。該dPCR通過將一種PCR反應分成許多更小的PCR反應(每個小的反應平均包括不超過一個靶核酸分子)來改進傳統的PCR。每個小的反應都大約包括1或0個靶核酸分子，并且在PCR擴增結束時給出陽性或陰性二進制讀數。確定陽性讀數的比例后，可以根據泊松統計模型計算靶基因的絕對比例。dPCR通過計算實際的靶分子數確定靶基因的絕對量，而不是用指數擴增循環數和通過與參考基因的比較來確定相對初始量。通過使用大數量劃分的方法，dPCR可以用于檢測比qPCR更精細的倍數差異。

由于dPCR僅涉及每個反應的陽性或陰性讀數，所以，經常通過檢測終點反應產物來進行該dPCR。但是，監測dPCR實時擴增可以提供有價值的信息以評估真的和假陽性，并且使用同樣的熒光探針能夠檢測多個靶序列。本發明提供了一種具有多個獨立控制的微型PCR反應器的實時數字PCR裝置，其可以進行多個獨立的并實時監測的dPCR擴增。

發明內容

本發明提供了一種可以進行多個獨立的數字PCR并具有實時監測能力的裝置。所述裝置包括多個與其自身的溫度控制元件熱耦合的PCR微型反應器、檢測單元、以及用于容納和移動所述PCR微型反應器的電動平臺。所述實時數字PCR裝置可以同時進行多個dPCR，生成單個PCR進程的擴增曲線，基于所述擴增曲線評估二進制讀數，并且基于所述擴增曲線識別不同的靶序列。