[發(fā)明專利]促進(jìn)環(huán)狀RNA circRNF13表達(dá)的試劑在制備治療舌鱗癌藥物上的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810168500.4
• 申請日: 2018-02-28
• 公開（公告）號: CN108384805B
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曾朝陽;熊芳;張姍姍;龔朝建;郭燦;劉凌云;熊煒;王裕民;莫勇真;張文玲;李小玲;李桂源
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;A61K31/7105;A61P35/00
• 代理公司: 長沙市融智專利事務(wù)所(普通合伙) 43114
• 代理人: 袁靖

1.促進(jìn)環(huán)狀RNA circRNF13表達(dá)的試劑在制備治療舌鱗癌藥物上的應(yīng)用，所述的環(huán)狀RNA circRNF13的序列如SEQ NO: 1所示；所述的促進(jìn)環(huán)狀RNA circRNF13表達(dá)的試劑為circRNF13過表達(dá)載體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，circRNF13過表達(dá)載體的構(gòu)建過程如下：

（1）根據(jù)circRNA 的形成機(jī)制和真核生物RNA 剪接的基本法則，設(shè)計出適用于circRNA表達(dá)的成環(huán)序列；根據(jù)商業(yè)化載體pcDNA3.1的序列信息，設(shè)計多克隆位點，從而得到完整的實現(xiàn)circRNA 過表達(dá)的DNA 序列如下：GTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCTACCACCCCCGGCCCACTTTTTCTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACATCGATTGGTGGAATTCTGCAGATATCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGAAAAGAATTAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCA，中間下劃線部分為多克隆位點，兩端分別為上、下游成環(huán)序列；

（2）將上述合成的實現(xiàn)circRNA 過表達(dá)的DNA 序列一端添加NheI酶切位點序列，另一端添加ApaI酶切位點序列，通過NheI 和ApaI 酶切后構(gòu)建入pcDNA3.1 載體中，得到pcCirc空白質(zhì)粒，測序確認(rèn)質(zhì)粒正確，序列如SEQ NO:13所示；

（3）選擇Cla I 和 Sac II酶切位點用于酶切pcCirc空白質(zhì)粒，并將circRNF13序列插入載體的上、下游成環(huán)序列之間。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（3）的具體過程如下：

1）以舌鱗癌細(xì)胞Tca8113 cDNA為模板，利用TaKaRa LA Taq? 酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增全長circRNF13序列；circRNF13全長序列擴(kuò)增引物如下：

上游引物：5’-GTGATTTTACAACGAGAT-3’；

下游引物：5’-CTTTCTTGAATTTATGTA-3’；

在上、下游引物的5’端分別加上限制性內(nèi)切酶Cla I和Sac II識別位點及保護(hù)堿基后，引物序列如下：

上游引物：5’- AGGAATCGAT GTGATTTTACAACGAGAT -3’ ，下劃線部分為Cla I識別位點；

下游引物：5’- ATGCCCGCGG CTTTCTTGAATTTATGTA -3’ ，下劃線部分為Sac II識別位點；

2）PCR擴(kuò)增，circRNF13全長序列，PCR反應(yīng)條件如下：

TaKaRa LA Taq? 酶 1μl

10μm上游引物 0.4μl

10μm下游引物 0.4μl

cDNA模板 2.0μl

dH₂O 12.2μl

5x PCR反應(yīng)緩沖液 4μl

Total 20μl，

PCR反應(yīng)步驟

1 94℃ 5 min

2 95℃ 10 sec

3 58℃ 30 sec

4 72℃ 60 sec

5 返回到第2步，共進(jìn)行39次反應(yīng)循環(huán)；

3）將PCR產(chǎn)物電泳、膠回收目的片段后經(jīng)Cla I 和 Sac II雙酶切后電泳，再次膠回收；

4）pcCirc空白質(zhì)粒經(jīng)Cla I 和 Sac II雙酶切后電泳膠回收目的片段；

5）以 T4 DNA連接酶連接 3）和4）步膠回收產(chǎn)物，即得到過表達(dá)circRNF13的載體質(zhì)粒；

6）將第5)步得到的包含circRNF13全長序列的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，以擴(kuò)增質(zhì)粒。