[發明專利]人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法和人臍帶間質干細胞外泌體的應用

有效

• 申請號: 201810168252.3
• 申請日: 2018-02-28
• 公開（公告）號: CN108103017B
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發明（設計）人: 許文榮;孫瑤湘;錢暉;張斌;史惠;紀成;孫豐田;嚴永敏;張徐;毛飛
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61P3/10
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明提供了人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法和人臍帶間質干細胞外泌體的應用，屬于醫藥技術領域。本發明用無血清培養基培養人臍帶間質干細胞，收集上清液，經過離心和超濾濃縮，得到濃縮液移至30％蔗糖重水密度墊上采用蔗糖密度離心進一步純化，得到人臍帶間質干細胞外泌體。本發明通過分離純化得到人臍帶間質干細胞外泌體有效降低免疫反應性，使用時保證劑量可控。所述人臍帶間質干細胞外泌體通過提高二型糖尿病動物模型胰島素信號通路的活化程度，抑制肝糖原合成分解，從而實現葡萄糖代謝穩態的調節，同時提高二型糖尿病動物模型對胰島素的敏感性及胰島β細胞的胰島素分泌功能降低血糖濃度，實現制備治療二型糖尿病的藥物的應用。

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法和人臍帶間質干細胞外泌體的應用。

背景技術

糖尿病(diabetes mellitus)是一種由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的代謝性疾病。過去30多年，國內糖尿病的發病率由低于1％增長至超過10％，糖尿病患者人數已超過1億，居全球第一，且不斷趨于年輕化。糖尿病已成為我國嚴重的公共衛生問題。90％～95％的糖尿病患者為2型糖尿病(T2DM)，2型糖尿病患者早期通過控制飲食、增強運動及口服降糖藥調節血糖，隨著病情的發展，大多數患者需要長期依賴外源性胰島素才能使血糖保持在正常范圍，降糖藥和胰島素都存在大量不良反應如胃腸道應激、骨質疏松、低血糖、胰島素注射部位皮下結節以及β細胞反饋性分泌功能喪失等，對于病情的控制及并發癥的預防都存在不足，因此，亟需尋找降低糖尿病患者血糖，減輕治療副作用并延緩糖尿病病情發展的新方法。

國內外諸多研究表明，間質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)在血糖調節和胰島細胞功能修復方面具有重要的作用，MSC能提高外周組織對胰島素的敏感性，使組織對血液中葡萄糖的利用增加，在糖尿病的干預方面表現出了一定的效果，但MSC的應用標準、免疫反應性、潛在致瘤性及轉基因技術的安全性等因素使MSC的在糖尿病治療中的應用受到限制。目前MSC在糖尿病的治療中存在較多毒副作用，僅用于控制病情對于病因沒有實質性的改善；還存在倫理，劑量不可控及安全性問題。

目前，外泌體與糖尿病的研究主要集中于疾病診斷，而用于糖尿病或糖代謝調控的僅有：Wen D等發現過表達anti-miR-375的骨髓MSC來源外泌體攜帶anti-miR-375抑制胰島移植的宿主免疫排斥反應(J Controlled Release,2016,238:166-175)；棕色脂肪組織來源的外泌體能夠轉運miR-99b至肝臟調控FGF-21表達(Nature,2017,542(7642):450)。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供人臍帶間質干細胞外泌體(MSC-ex)的分離純化方法和人臍帶間質干細胞外泌體的應用，分離純化的人臍帶間質干細胞外泌體對糖尿病的病因直接干預，具有安全性可控的特點。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法，包括以下步驟：

(1)將人臍帶間質干細胞在無血清培養基上培養45～50h，收集培養上清液，離心，收集上層液，得到人臍帶間質干細胞外泌體粗液；

(2)將所述步驟(1)中人臍帶間質干細胞外泌體粗液經超濾濃縮離心，得到濃縮液；所述超濾用超濾膜為100000Da規格；所述離心速度為1000～2000g；所述離心時間為15～20min；

(3)將所述步驟(2)中的濃縮液移至質量濃度為30％的蔗糖重水密度墊上，在4℃條件下，80000～160000g密度梯度離心120min，收集底部緩沖墊；

(4)將所述步驟(3)中底部緩沖墊經PBS溶液洗滌后置于100000Da MWCO超濾離心管中洗滌，收集濃縮液，得到人臍帶間質干細胞外泌體。