[發明專利]用于高通量分析的微流控細胞捕獲和分析設備

在審

• 申請號: 201810167155.2
• 申請日: 2011-05-27
• 公開（公告）號: CN108424834A
• 公開（公告）日: 2018-08-21
• 發明（設計）人: 卡爾·拉爾斯·真吉斯·漢森;邁克爾·萬因斯伯格;亞當·懷特;奧勒哈·彼特里弗;提姆·利弗;阿努帕姆·辛哈爾;威廉·鮑登;韋羅妮克·勒科特;丹·達科斯塔;里奧·吳;喬治婭·拉塞爾;達雷克·西科爾斯基
• 申請（專利權）人: 不列顛哥倫比亞大學
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12M3/00;C12Q1/02;C12Q1/686
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

提供了用于捕獲、分離和處理單細胞的微流控裝置。所述微流控裝置包括細胞捕獲室，其具有位于細胞捕獲室內的細胞漏斗，從而引導細胞通過細胞捕獲室流向一個或多個位于該漏斗下游的細胞捕獲器，以接收流動的細胞。所述裝置可進一步包括與細胞捕獲室一體的輔助室，用于隨后處理和分析所捕獲細胞的內含物。還提供了細胞捕獲和制備方法，其包括使細胞流經室，并使細胞經漏斗流向細胞捕獲器，在所述捕獲器內捕獲預定數目的細胞，中斷所述細胞流，使洗滌液流經所述室以從所述室中去除污染物，以及將所述預定數目的細胞封閉于所述室內。

發明背景

1.發明領域

本發明涉及微流控裝置。具體地，本發明涉及微流控裝置及其用途,以及用于分析細胞的方法。

2.相關技術描述

單細胞代表基本生物單位。然而，大多數生物知識呈現為研究細胞群而非單細胞的結果。難免存在基礎和應用問題，如涉及干細胞分化的轉錄控制、基因表達中的固有噪聲和疾病起源的問題，這只能從單細胞水平上來解決。例如，單細胞分析允許直接測量基因表達動力學或清楚地鑒別共調控的基因，甚至存在會使普通群體測量不清楚的非同步性和異質性時也是如此。類似地，單細胞方法在干細胞研究和癌癥生物學中至關重要，其中由于受純化方案限制而分離的原代細胞群為異質的，并且通常只有少數細胞群是最相關的。因此，高通量單細胞測量技術受關注并在臨床和研究環境中具有廣泛的應用。

測量單細胞中轉錄水平的現有方法包括RT-qPCR(1)、使用數字PCR(2)的單分子計數，或雜交探針(3,4)以及新一代測序(5)。在這些方法中，單細胞RT-qPCR提供了靈敏、特異和動態范圍的綜合優點，但其受低通量、試劑費用高和難以準確測量低豐度轉錄本的限制(6)。

微流控裝置使用活動閥門來定位和分離細胞，允許對單個微生物細胞進行分離和基因組擴增(32)。遺憾的是，由于涉及操作閥門機構的手動操作，該裝置不能進行高通量分析。此外，所述裝置不能使分離的細胞在處理和分析之前從上清液中洗滌出來。反過來這會產生污染事件，并進一步限制該裝置的下游應用。

因此，微流體研究的目標是開發出可對單細胞中的轉錄進行可擴展分析的綜合技術。微流控系統提供了用于單細胞分析的眾多優點：測量的經濟性、平行化和自動化，以及提高來自小量反應的靈敏度和精確度。過去十年中，人們投入了大量精力用于研發在芯片上集成和可擴展的單細胞遺傳分析(7,8)。因此，微流控單細胞基因表達分析的許多基本功能已經在分離包括細胞操作和捕獲(9,10)、RNA純化和cDNA合成(11-13)，以及芯片外細胞分離cDNA合成和預擴增后的微流控qPCR(14)中得到展示。具體地，最近已將微流控qPCR裝置(Biomark動態陣列，Fluidigm公司)應用到單細胞研究中(15,16)。盡管這些系統提供了高通量qPCR數據讀出，但是它們沒有進行前段樣品制備，且需要通過FACS或微量移液管進行單細胞分離，然后在分析前進行芯片外處理和起始模板的預擴增。將單細胞分析的所有步驟集成于一個能測量大量細胞的強大系統的關鍵步驟還有待報道。Toriello等人描述了直接測量單細胞基因表達的集成裝置的單獨示范，組合了RNA捕獲、PCR擴增和使用集成毛細管電泳的擴增子末端檢測的所有步驟(17)。盡管該系統的工程復雜，通量被限制于每輪4個細胞，細胞捕獲需要細胞代謝標記，且所述分析不是定量的。

在許多類型的分析之前，需要分離單細胞或有限數目的細胞，這通常需要使用細胞捕獲機構。對于單細胞或少量細胞進行可靠和可擴展分析的目標而言，低捕獲通量和低捕獲效率成為巨大的挑戰。低捕獲效率需要成千上萬個細胞以使在使用細胞系時少量單細胞測量不成問題，然而，在使用稀少細胞類型如干細胞的原代樣品時，這就成為一個大問題。同樣，對所捕獲細胞和通過所述捕獲器的細胞的觀察表明，細胞捕獲效率取決于細胞大小，其可能潛在地將偏差引入到單細胞測量中。

發明概述