[發(fā)明專(zhuān)利]用于高通量分析的微流控細(xì)胞捕獲和分析設(shè)備

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810166622.X
• 申請(qǐng)日: 2011-05-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108531360A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 卡爾·拉爾斯·真吉斯·漢森;邁克爾·萬(wàn)因斯伯格;亞當(dāng)·懷特;奧勒哈·彼特里弗;提姆·利弗;阿努帕姆·辛哈爾;威廉·鮑登;韋羅妮克·勒科特;丹·達(dá)科斯塔;里奧·吳;喬治婭·拉塞爾;達(dá)雷克·西科爾斯基
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 不列顛哥倫比亞大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12M1/00
• 分類(lèi)號(hào): C12M1/00;C12M3/00;C12N5/07;C12Q1/02;C12Q1/686;G01N33/50;G01N33/543;G01N33/569;G01N1/34
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11204
• 代理人: 王達(dá)佐;洪欣

提供了用于捕獲、分離和處理單細(xì)胞的微流控裝置。所述微流控裝置包括細(xì)胞捕獲室，其具有位于細(xì)胞捕獲室內(nèi)的細(xì)胞漏斗，從而引導(dǎo)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞捕獲室流向一個(gè)或多個(gè)位于該漏斗下游的細(xì)胞捕獲器，以接收流動(dòng)的細(xì)胞。所述裝置可進(jìn)一步包括與細(xì)胞捕獲室一體的輔助室，用于隨后處理和分析所捕獲細(xì)胞的內(nèi)含物。還提供了細(xì)胞捕獲和制備方法，其包括使細(xì)胞流經(jīng)室，并使細(xì)胞經(jīng)漏斗流向細(xì)胞捕獲器，在所述捕獲器內(nèi)捕獲預(yù)定數(shù)目的細(xì)胞，中斷所述細(xì)胞流，使洗滌液流經(jīng)所述室以從所述室中去除污染物，以及將所述預(yù)定數(shù)目的細(xì)胞封閉于所述室內(nèi)。

發(fā)明背景

1.發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微流控裝置。具體地，本發(fā)明涉及微流控裝置及其用途, 以及用于分析細(xì)胞的方法。

2.相關(guān)技術(shù)描述

單細(xì)胞代表基本生物單位。然而，大多數(shù)生物知識(shí)呈現(xiàn)為研究細(xì)胞 群而非單細(xì)胞的結(jié)果。難免存在基礎(chǔ)和應(yīng)用問(wèn)題，如涉及干細(xì)胞分化的 轉(zhuǎn)錄控制、基因表達(dá)中的固有噪聲和疾病起源的問(wèn)題，這只能從單細(xì)胞 水平上來(lái)解決。例如，單細(xì)胞分析允許直接測(cè)量基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)或清楚 地鑒別共調(diào)控的基因，甚至存在會(huì)使普通群體測(cè)量不清楚的非同步性和 異質(zhì)性時(shí)也是如此。類(lèi)似地，單細(xì)胞方法在干細(xì)胞研究和癌癥生物學(xué)中 至關(guān)重要，其中由于受純化方案限制而分離的原代細(xì)胞群為異質(zhì)的，并 且通常只有少數(shù)細(xì)胞群是最相關(guān)的。因此，高通量單細(xì)胞測(cè)量技術(shù)受關(guān) 注并在臨床和研究環(huán)境中具有廣泛的應(yīng)用。

測(cè)量單細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平的現(xiàn)有方法包括RT-qPCR(1)、使用數(shù)字PCR (2)的單分子計(jì)數(shù)，或雜交探針(3,4)以及新一代測(cè)序(5)。在這些方法中， 單細(xì)胞RT-qPCR提供了靈敏、特異和動(dòng)態(tài)范圍的綜合優(yōu)點(diǎn)，但其受低通 量、試劑費(fèi)用高和難以準(zhǔn)確測(cè)量低豐度轉(zhuǎn)錄本的限制(6)。

微流控裝置使用活動(dòng)閥門(mén)來(lái)定位和分離細(xì)胞，允許對(duì)單個(gè)微生物細(xì) 胞進(jìn)行分離和基因組擴(kuò)增(32)。遺憾的是，由于涉及操作閥門(mén)機(jī)構(gòu)的手動(dòng) 操作，該裝置不能進(jìn)行高通量分析。此外，所述裝置不能使分離的細(xì)胞 在處理和分析之前從上清液中洗滌出來(lái)。反過(guò)來(lái)這會(huì)產(chǎn)生污染事件，并 進(jìn)一步限制該裝置的下游應(yīng)用。

因此，微流體研究的目標(biāo)是開(kāi)發(fā)出可對(duì)單細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行可擴(kuò)展 分析的綜合技術(shù)。微流控系統(tǒng)提供了用于單細(xì)胞分析的眾多優(yōu)點(diǎn)：測(cè)量 的經(jīng)濟(jì)性、平行化和自動(dòng)化，以及提高來(lái)自小量反應(yīng)的靈敏度和精確度。 過(guò)去十年中，人們投入了大量精力用于研發(fā)在芯片上集成和可擴(kuò)展的單 細(xì)胞遺傳分析(7,8)。因此，微流控單細(xì)胞基因表達(dá)分析的許多基本功能 已經(jīng)在分離包括細(xì)胞操作和捕獲(9,10)、RNA純化和cDNA合成(11-13)， 以及芯片外細(xì)胞分離cDNA合成和預(yù)擴(kuò)增后的微流控qPCR(14)中得到展 示。具體地，最近已將微流控qPCR裝置(Biomark動(dòng)態(tài)陣列，F(xiàn)luidigm公 司)應(yīng)用到單細(xì)胞研究中(15,16)。盡管這些系統(tǒng)提供了高通量qPCR數(shù)據(jù) 讀出，但是它們沒(méi)有進(jìn)行前段樣品制備，且需要通過(guò)FACS或微量移液 管進(jìn)行單細(xì)胞分離，然后在分析前進(jìn)行芯片外處理和起始模板的預(yù)擴(kuò)增。 將單細(xì)胞分析的所有步驟集成于一個(gè)能測(cè)量大量細(xì)胞的強(qiáng)大系統(tǒng)的關(guān)鍵 步驟還有待報(bào)道。Toriello等人描述了直接測(cè)量單細(xì)胞基因表達(dá)的集成裝 置的單獨(dú)示范，組合了RNA捕獲、PCR擴(kuò)增和使用集成毛細(xì)管電泳的擴(kuò) 增子末端檢測(cè)的所有步驟(17)。盡管該系統(tǒng)的工程復(fù)雜，通量被限制于每 輪4個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞捕獲需要細(xì)胞代謝標(biāo)記，且所述分析不是定量的。

在許多類(lèi)型的分析之前，需要分離單細(xì)胞或有限數(shù)目的細(xì)胞，這通 常需要使用細(xì)胞捕獲機(jī)構(gòu)。對(duì)于單細(xì)胞或少量細(xì)胞進(jìn)行可靠和可擴(kuò)展分 析的目標(biāo)而言，低捕獲通量和低捕獲效率成為巨大的挑戰(zhàn)。低捕獲效率 需要成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞以使在使用細(xì)胞系時(shí)少量單細(xì)胞測(cè)量不成問(wèn)題，然 而，在使用稀少細(xì)胞類(lèi)型如干細(xì)胞的原代樣品時(shí)，這就成為一個(gè)大問(wèn)題。 同樣，對(duì)所捕獲細(xì)胞和通過(guò)所述捕獲器的細(xì)胞的觀察表明，細(xì)胞捕獲效 率取決于細(xì)胞大小，其可能潛在地將偏差引入到單細(xì)胞測(cè)量中。

發(fā)明概述