[發明專利]F型三系雜交小麥雄性不育基因相關分子標記開發及應用

在審

• 申請號: 201810161480.8
• 申請日: 2018-02-27
• 公開（公告）號: CN110195100A
• 公開（公告）日: 2019-09-03
• 發明（設計）人: 吳坤;楊雅生;馮樹英
• 申請（專利權）人: 創世紀種業有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6858;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 屈靜

1.一種F型三系雜交小麥雄性不育基因相關SNP位點的特異PCR標記開發方法，所述方法包括：

(1)將小麥通過多代姊妹交，將獲得的自交系分成自交結實率高的保持系和自交結實率中等的保持系，以及自交結實率低于5％的穩定不育系，三者除育性差異，其他生物學特征完全一致；

(2)對上述三個樣品進行建庫測序：提取上述三個樣品的基因組DNA，建庫后進行測序；

(3)基因組序列比較分析：比對小麥參考基因組數據庫中線粒體及細胞核參考基因組序列，檢索三個樣品線粒體及細胞核基因組間存在的SNP變異；

(4)F型雄性不育基因相關SNP位點特異PCR標記開發：針對上述不育系與不同自交結實率的保持系株系間鑒定獲得的線粒體及細胞核基因組SNP位點，檢測、設計和開發限制性內切酶擴增多態性序列(CAPS)標記或競爭性等位基因特異性PCR(KASP)標記。

2.根據權利要求1所述的方法，所述多代是指8代以上。

3.根據權利要求1或2所述的方法，通過Hiseq2000進行測序。

4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，運用BWA軟件與小麥參考基因組序列進行比對，并利用GATK軟件包進行SNP信息的檢測和注釋。

5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，利用Annovar程序結合參考基因組的gff注釋信息對得到的純合SNP進行注釋，并通過Goatools進行富集分析，利用KOBAS進行KEGGpathway富集分析。

6.根據權利要求1-5任一項所述的方法，通過DNAMAN和Primer Premier5.0檢測、設計和開發限制性內切酶擴增多態性序列標記或競爭性等位基因特異性PCR標記。

7.根據權利要求1-6任一項的方法獲得的F型三系雜交小麥雄性不育基因相關SNP位點分子標記，所述SNP位點包括3個SNP位點，第1個SNP位于358137bp為PsaA/PsaB基因內同義突變C變成T，第2和3個SNP分別位于419226bp和419241bp為NdhB基因內非同義突變T變成C。

8.根據權利要求7的F型三系雜交小麥雄性不育基因相關SNP位點分子標記的檢測方法，所述方法包括：

用以下引物進行PCR擴增：正向引物：5’GCATAACGGCCCTATTGTTCC3’；反向引物：5’CGAACGAACCACACTCCTTC3’；

用限制性內切酶對PCR產物酶切，所用限制性內切酶為Bsp1407I。

9.根據權利要求8所述的方法，PCR擴增退火溫度Tm＝59℃，延伸時間40S。

10.根據權利要求8或9所述的方法，酶切在37℃下進行。