[發(fā)明專利]一種甲烷單細胞蛋白的生產方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810161056.3
• 申請日: 2018-02-27
• 公開（公告）號: CN108285884A
• 公開（公告）日: 2018-07-17
• 發(fā)明（設計）人: 儲衛(wèi)華;周淑鑫
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467
• 代理人: 王斌

1.一種甲烷單細胞蛋白的工業(yè)化生產方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）、使用莢膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009、土壤短芽孢桿菌Brevibacillus agri ACCC10247以及嗜熱嗜氣硫胺素芽孢桿菌Aneurinibacillus thermoaerophilus ACCC10261中任意一種或任意兩種以上混合物；

將甘油管保藏的菌種0.5mL 接種至無機鹽試管斜面培養(yǎng)基上，通入經過0.22μm 孔徑的微孔濾膜過濾除菌的甲烷氣體，30℃培養(yǎng)4 d，即得斜面種子，所述的無機鹽試管斜面培養(yǎng)基為在1L 水中加入1.5g K₂HPO₄、0.5g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄ ?7H₂O、1.0g NaCl、1.0g（NH₄）₂SO₄和20g 瓊脂，pH 自然；用無菌水將斜面種子全部沖洗下來，以無機鹽液體培養(yǎng)基體積1%-5% 的接種量接入到含有石蠟油的無機鹽液體培養(yǎng)基中，通入經過0.22μm 孔徑的微孔濾膜過濾除菌的甲烷氣體，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉速220rpm，培養(yǎng)4-6 d，菌體OD₆₀₀ 達到9 ～10，獲得搖瓶種子，所述的無機鹽液體培養(yǎng)基為在1L 水中加入1.5gK₂HPO₄、0.5g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄ ?7H₂O、1.0g NaCl和1.0g（NH₄）₂SO₄，pH 自然；所述含甲烷的體系中石蠟油添加量為2.0%-3.0% v/v；所述含甲烷的體系中甲烷和空氣體積比為1:1-1:5，每24h-48h 換氣一次；

2）、一級種子培養(yǎng)：

A、一級種子培養(yǎng)在50L的發(fā)酵罐中進行，步驟如下：按步驟1）所述方法在50L 罐中配制30L 的無機鹽液體培養(yǎng)基，加入2.5％v/v的石蠟油，打開蒸汽閥，使蒸汽進發(fā)酵罐夾套層，對培養(yǎng)基進行滅菌，滅菌溫度121℃，滅菌時間30min，對液體培養(yǎng)基滅菌的同時，對空氣過濾器和取樣口進行滅菌，滅菌10min 即可，滅菌結束后，打開進氣閥，向發(fā)酵罐中通入無菌空氣，使罐體內空氣壓力一直要高于罐體外大氣壓，打開冷卻水閥門，使冷卻水進發(fā)酵罐夾套層，對無機鹽液體培養(yǎng)基進行降溫，當無機鹽液體培養(yǎng)基溫度降至25-35℃時，開始接種；

B、搖瓶種子1000mL 從50L 發(fā)酵罐接種口倒入，隨后控制發(fā)酵溫度在20-30℃，轉速150rpm，通入經過0.22μm 孔徑的微孔濾膜過濾除菌的甲烷氣體，培養(yǎng)5-7d 后，得一級種子；

3）、二級種子培養(yǎng)：

二級種子培養(yǎng)在5m³ 發(fā)酵罐中進行，二級種子培養(yǎng)基采用無機鹽液體培養(yǎng)基，步驟如下：

5m³ 發(fā)酵罐中裝含2.5％v/v石蠟油的無機鹽液體培養(yǎng)基體積為3m³ ；所述的無機鹽液體培養(yǎng)基為：1L 水中加入1.5g K₂HPO₄、0.5g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄ ?7H₂O、1.0g NaCl和1.0g（NH₄）₂SO₄，pH 自然；

用2）A 步驟中的滅菌方法對含2.5％v/v石蠟油的無機鹽液體培養(yǎng)基進行滅菌，滅菌完成后，將培養(yǎng)好的一級種子30L 接種到3m³的無機鹽液體培養(yǎng)基中，接種量為1%，接種時二級種子罐罐壓在0.01-0.03MPa，一級種子罐罐壓在0.05-0.1MPa，通過氣壓將一級種子從一級種子罐壓到二級種子罐中，接種完成后，保持二級種子罐溫度20-30℃，1 ：1-1.5vvm通入經過0.22μm 孔徑的微孔濾膜過濾除菌的甲烷氣體，罐壓0.05MPa，pH自然，培養(yǎng)6-8d，得二級種子；

4）、發(fā)酵罐甲醇蛋白生產

發(fā)酵培養(yǎng)基為與3）步驟中的二級種子培養(yǎng)基相同，開啟進料泵，調節(jié)進料閥門大小，以控制發(fā)酵培養(yǎng)基的進料速度為3-4m³/h，同時打開蒸汽閥門，將蒸汽與發(fā)酵培養(yǎng)基混合，使發(fā)酵培養(yǎng)基溫度達到121-125℃，進入在層流罐中維持20min 后，進入50m³ 發(fā)酵罐中，進料完畢后，關閉進料閥，并將50m³ 發(fā)酵罐溫度維持在121℃ 30min，此時，用蒸汽對與50m³ 發(fā)酵罐相連的空氣過濾器、發(fā)酵罐取樣口、出料口、排氣口管道進行滅菌，保證50m³ 發(fā)酵罐及與之相連管道呈無菌狀態(tài)，滅菌結束后，對50m³ 發(fā)酵罐內的發(fā)酵培養(yǎng)基降溫到30℃-35℃；然后將二級種子以發(fā)酵培養(yǎng)基體積10% 的接種量接種到50m³ 發(fā)酵罐內開始發(fā)酵，發(fā)酵溫度20-30℃，1 ：1.5-2 vvm通入經過0.22μm 孔徑的微孔濾膜過濾除菌的甲烷，罐壓0.04MPa，pH自然，培養(yǎng)7-9d得發(fā)酵液；

5）、出料

發(fā)酵結束后，利用罐壓將發(fā)酵液從出料管道導入到發(fā)酵液儲罐中，靜置，沉降4-8 小時，沉降液經臥螺離心機離心，得菌泥，收集到儲存罐中，加入菌泥體積1/5 的清水，攪拌均勻，進入噴霧干燥機，噴霧干燥，收集蛋白干粉，包裝。

2. 根據權利要求1 所述的甲烷單細胞蛋白的工業(yè)化生產方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）、搖瓶種子培養(yǎng)：

將甘油管保藏的菌種0.5mL 用劃線法接種至無機鹽試管斜面培養(yǎng)基上，通入經過0.22μm 孔徑的微孔濾膜過濾除菌的甲烷氣體，30℃培養(yǎng)4d，即得斜面種子；取1支培養(yǎng)好的斜面種子，用10mL無菌水將斜面種子全部沖洗下來，接種到裝有250mL 無機鹽液體培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶口用8 層紗布包好，通入經過0.22μm 孔徑的微孔濾膜過濾除菌的甲烷氣體，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉速220rpm，培養(yǎng)4-6d 后，菌體OD₆₀₀ 達到9-10，獲得搖瓶種子；

2）、一級種子培養(yǎng)：

A、在50L 發(fā)酵罐中先加水10L，再投入45g K₂HPO₄、15g KH₂PO₄、6g MgSO₄ ?7H₂O、30gNaCl和30g（NH₄）₂SO₄，750mL石蠟油，pH 自然，攪拌溶解，然后再加水至30L 得YPD 液體培養(yǎng)基，打開罐體蒸汽閥進口，通蒸汽進發(fā)酵罐夾套層，將無機鹽液體培養(yǎng)基進行滅菌，滅菌溫度121℃，時間30min，同時，對發(fā)酵罐的空氣過濾器和取樣口滅菌10min，滅菌結束后，打開進氣閥，向發(fā)酵罐中通入無菌空氣，使罐體內空氣壓力一直要高于罐體外大氣壓，同時使冷卻水進入罐體夾套對培養(yǎng)基降溫，當培養(yǎng)基溫度降至30℃時，開始接種；

B、搖瓶種子1000mL 從50L 發(fā)酵罐接種口倒入，接種前檢查種子質量，要求無雜菌污染，菌體健壯、形態(tài)一致、均勻整齊，接種后，控制發(fā)酵罐溫度30℃，轉速150rpm，通入經過0.22μm 孔徑的微孔濾膜過濾除菌的甲烷氣體，培養(yǎng)5-7d 后，得一級種子；

3）、二級種子培養(yǎng)：

將3m³ 含2.5％（v/v）石蠟油的無機鹽液體培養(yǎng)基裝入5m³ 發(fā)酵罐中，用2）A 步驟中的滅菌方法對培養(yǎng)基進行滅菌，滅菌完成后，將30L一級種子通過壓力管道接種到5m³ 發(fā)酵罐內液體培養(yǎng)基中，接種時二級種子罐罐壓在0.01-0.03MPa，一級種子罐罐壓在0.05-0.1MPa，通過氣壓將一級種子從一級種子罐壓到二級種子罐中，接種完成后，保持二級種子罐溫度20- 30℃，1 ：1-1.5vvm通入經過0.22μm 孔徑的微孔濾膜過濾除菌的甲烷氣體，罐壓0.05MPa，pH自然，培養(yǎng)6-8d，得二級種子；

4）、50m³ 發(fā)酵罐中甲烷單細胞蛋白的發(fā)酵生產

發(fā)酵培養(yǎng)基為與3）步驟中的二級種子所用含2.5％（v/v）石蠟油的無機鹽液體培養(yǎng)基相同配方，首先將30m³ 發(fā)酵培養(yǎng)基投入到配料罐內，開啟進料泵，調節(jié)進料閥門大小，以控制發(fā)酵培養(yǎng)基的進料速度為4m³/h，同時打開蒸汽閥門，將蒸汽與發(fā)酵培養(yǎng)基混合，使發(fā)酵培養(yǎng)基溫度達到125℃，進入層流罐中維持20min 后，進入50m³ 發(fā)酵罐中，當進料完畢后，關閉進料閥，并將50m³ 發(fā)酵罐溫度維持在121℃ 30min，此時，用蒸汽對與50m³ 發(fā)酵罐相連的空氣過濾器、發(fā)酵罐取樣口、出料口、排氣口管道進行滅菌，保證50m³ 發(fā)酵罐及與之相連管道呈無菌狀態(tài)，滅菌結束后，打開50m³ 發(fā)酵罐內盤管冷卻管進水閥門，對發(fā)酵培養(yǎng)基降溫；待發(fā)酵培養(yǎng)基溫度降到30℃時，將3m³ 二級種子接種到50m³ 發(fā)酵罐內發(fā)酵，發(fā)酵溫度20-30℃， 1 ：1.5-2 vvm通入經過0.22μm 孔徑的微孔濾膜過濾除菌的甲烷，罐壓0.04MPa，pH自然，培養(yǎng)7-9d得發(fā)酵液；

5）、出料

發(fā)酵結束后，利用罐壓將發(fā)酵液從出料管道導入到兩個25m³ 的發(fā)酵液儲罐中，靜置沉降4-8 小時，沉降液經臥螺離心機離心，離心機轉速3000轉/分鐘，進料量5噸/小時，離心獲得菌泥，收集到發(fā)酵液儲存罐中，向發(fā)酵液儲存罐中加入2m³清水，攪拌均勻，進入噴霧干燥機，調節(jié)進口溫度至130-150℃、出口溫度至65-80℃，進料流量為1 噸/小時，進行噴霧干燥，收集蛋白干粉，包裝。