[發明專利]一種心型脂肪酸結合蛋白抗體片段復合膠乳顆粒及其制備方法

在審

• 申請號: 201810158496.3
• 申請日: 2018-02-26
• 公開（公告）號: CN108445224A
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發明（設計）人: 王賢俊;鄭蓓蕾
• 申請（專利權）人: 王賢俊
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C07K16/00;C12P21/06
• 代理公司: 溫州名創知識產權代理有限公司 33258
• 代理人: 陳加利

1.一種心型脂肪酸結合蛋白抗體片段復合膠乳顆粒的制備方法，其特征在于，其特征在于：運用抗體片段化技術，在含半胱氨酸的緩沖環境下，先由無花果蛋白酶對h－FABP抗體進行切割，形成h－FABP抗體F(ab')2片段和Fc的多肽碎片，經Protein A離心柱洗脫純化，去除Fc的多肽碎片，獲得純化的h－FABP抗體F(ab')2片段，再將h－FABP抗體F(ab')2片段交聯于羧基膠乳微球上，形成心型脂肪酸結合蛋白抗體片段復合膠乳顆粒。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)由無花果蛋白酶將h－FABP抗體切割成F(ab')2片段；

將h－FABP抗體用離心式去鹽柱脫鹽，脫鹽所用緩沖液為0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；取相同的磷酸鹽緩沖液20ml，加入無花果蛋白酶1mg，1mol/L半胱氨酸溶液1ml，0.5mol/L EDTA溶液1ml，置于37℃，100r/min恒溫水浴搖床中均勻溶解2h；過Sephadex G50柱，并用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集獲得含活化的無花果蛋白酶酶溶液，并濃縮至原體積；以體積比5：1混合透析后的h－FABP抗體與活化無花果蛋白酶酶溶液，置于37℃，100r/min恒溫水浴搖床中酶解3h，3h后再次加入等量的活化無花果蛋白酶酶溶液繼續酶解3h，重復三次；酶解結束后加入0.1mmol/L碘乙酰胺0.5ml冰浴1h終止反應；過Protein A離心柱，并用含0.1mol/L NaCl的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液進行洗脫，最后用超純水透析24h，收集獲得h－FABP抗體F(ab')2片段，置于2-8℃保存；

(2)將h－FABP抗體F(ab')2片段交聯于羧基膠乳微球上，形成h－FABP抗體片段復合膠乳顆粒

取粒徑為120nm濃度為10％膠乳微球1ml，加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液9ml，室溫震蕩2mins，混合均勻后迅速加入120μl 50mg/ml EDC水溶液，加入150μl100mg/ml N-羥基硫代琥珀酰亞胺水溶液，室溫攪拌40min，2-8℃離心30min，轉速為15000rpm，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌三次，除去上清液，沉淀用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液1ml超聲重懸；取0.5ml h－FABP抗體F(ab')2片段，加入0.5ml膠乳微球重懸液，室溫攪拌1h，再重復加入0.5ml膠乳微球重懸液，繼續室溫攪拌3h，加入400μl 5％鹽酸羥胺水溶液淬滅試劑和200μl 1％BSA水溶液，室溫震蕩1h；4℃離心30min，轉速為15000rpm，沉淀用0.2mol/L、pH6.5磷酸鹽緩沖液洗滌三次，除去上清液，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液1ml超聲分散30mins，2-8℃密封保存。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的h－FABP抗體選擇鼠抗人h－FABP抗體。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液pH為6.5。

5.一種根據權利要求1-4任一項所述的制備方法制備的心型脂肪酸結合蛋白抗體片段復合膠乳顆粒。