[發(fā)明專利]基于POCT模式的CYP3A5*3基因型快速檢測試劑盒

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810152056.7
• 申請日: 2018-02-14
• 公開（公告）號: CN109251972A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賀庭禎;羅德朋;向霄;熊偉;黎幫勇;鐘越;劉黎;董銳;崔奇新;楊園
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶京因生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發(fā)明提供一種基于POCT模式的CYP3A5*3基因型快速檢測試劑盒，所述試劑盒至少含有用于檢測CYP3A5*3(rs776746)基因型的熒光定量PCR引物和探針(SEQ ID NO:1?4)及細胞裂解液，此外還可包括dNTPs、DNA聚合酶、Mg²⁺、反應緩沖液、標準陽性模板、采樣棒、樣品收集管等。本試劑盒可實現(xiàn)即時檢測，無需DNA提純，可將樣本直接加入試劑中進行PCR反應，特別適合DNA含量較低樣本(如口腔脫落細胞)的快速、準確檢測，檢測準確率達99％以上，檢測靈敏度高，可準確檢測低至0.125ng基因組DNA；整個檢測耗時短，1小時內(nèi)可得檢測結(jié)果，能在第一時間給醫(yī)生提供用藥依據(jù)，降低患者用藥風險。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于POCT模式的CYP3A5*3基因型快速檢 測試劑盒。

背景技術(shù)

CYP3A5是細胞色素P450(CYP)基因超家族成員，主要在肝臟、前列腺、小腸和大腸中表達， 是一種參與外來化合物代謝、膽固醇及類固醇合成的單氧酶。

研究表明，CYP3A5基因的遺傳多樣性是導致CYP3A5蛋白功能改變的主要原因。CYP3A5基 因存在多個突變位點，其中，命名為CYP3A5*3(6986A>G，rs776746)的單核苷酸突變會導致該 基因在轉(zhuǎn)錄為mRNA時被過早剪切，最終形成不完整的蛋白，使其喪失功能。1000 genome project phase 3提供的數(shù)據(jù)表明，CYP3A5*3等位基因在中國西雙版納傣族人群中出現(xiàn)的頻率占68.82％；中 國北京漢族人群中CYP3A5*3等位基因的頻率占68.93％；在中國南方漢族人群中CYP3A5*3等位基 因的頻率占72.86％。

由于CYP3A5是眾多藥物在人體中代謝的重要代謝酶，因此攜帶CYP3A5*3等位基因的患者在 臨床藥物治療過程中的表現(xiàn)與野生型等位基因CYP3A5*1攜帶者大相徑庭。例如，用于預防和治 療器官移植后排異反應的免疫抑制劑他克莫司(tacrolimus,FK506)的代謝就是由CYP3A5編碼的 代謝酶完成，從而發(fā)揮其免疫抑制作用。

研究表明，攜帶CYP3A5*3等位基因的患者的血漿FK506濃度遠遠大于攜帶CYP3A5*1野生型 等位基因的正常代謝者，導致諸如腎毒性、神經(jīng)毒性、高血壓和胃腸道紊亂等一系列藥物毒副作用。 據(jù)文獻統(tǒng)計，在我國69％～73％的人群面臨CYP3A5相關(guān)代謝藥物的用藥風險，因此快速、準確的 CYP3A5基因分型檢測對器官移植病人的術(shù)后個體化用藥有著重大的臨床意義。

目前，檢測CYP3A5*3的方法主要有測序法、基因芯片法和熒光定量PCR法。

測序法和基因芯片法對檢測結(jié)果具有很高的精度，其依賴大型精密儀器設(shè)備、固定實驗室以 及專業(yè)操作人員，因此，這兩種檢測方法成本高，步驟繁瑣并且耗時長，在臨床上很難進行推廣。

雖然降低了測序法和基因芯片法中的儀器和試劑的成本，但其操作復雜，步驟繁多，也不適 用于臨床。CN105274221A公開了一種等位基因特異擴增法(ARMS-PCR)，該方法在PCR反應后 需要使用凝膠電泳分析結(jié)果。這種開放式的操作很容易導致環(huán)境污染，影響結(jié)果的準確性，不適合 臨床推廣。目前常規(guī)的檢測技術(shù)難以滿足國內(nèi)攜帶CYP3A5*3突變基因的人群對CYP3A5基因檢測 快速、準確的要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一套用于檢測CYP3A5*3(rs776746)基因型的熒光定量PCR引物和探針。

本發(fā)明的另一目的是提供一種基于POCT模式的CYP3A5*3(rs776746)基因型快速檢測試劑 盒。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一套用于檢測CYP3A5*3(rs776746)基因型的熒光定量PCR 引物和探針，包括上游引物、下游引物、野生型探針和突變型探針，它們的核苷酸序列分別如下(SEQ ID NO:1-4)：