[發明專利]一種基于細胞代謝組學的甜茶素抗脂毒性的差異代謝物代謝通路及研究方法

在審

• 申請號: 201810150407.0
• 申請日: 2018-02-13
• 公開（公告）號: CN108414635A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 鄭華;蘇志恒;吳金霞;孟春梅;黃遠潔;李衛東;何麗麗
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 王素娥

1.一種基于細胞代謝組學的甜茶素抗脂毒性的差異代謝物代謝通路及研究方法，其特征在于：采用基于超高液相色譜-串聯質譜技術檢測分析棕櫚酸誘導大鼠胰島素瘤細胞及甜茶素干預后的細胞內代謝產物，獲得代謝指紋圖譜。利用多元變量統計分析篩選出十二個潛在脂毒性相關的生物標志物并進行鑒定，通過metaboanalyst在線分析軟件篩選出甜茶素抗脂毒性的四個代謝通路和代謝通路上相關酶和基因；

所述獲得代謝指紋圖譜的具體實現步驟如下：

(1)所需細胞樣品的采集：取生長狀態良好的大鼠胰島素瘤細胞接種于96孔培養板，按隨機原則分為對照組、棕櫚酸模型組和甜茶素干預組，每組三個樣品，把收集到細胞的離心管放到液氮和37℃水浴箱中反復凍融五個周期，每個周期為液氮5min，37℃水浴5min，進行淬滅；

(2)細胞樣品的預處理和保存：在離心管中加入1mL乙腈，在溫度4℃條件下離心10min，離心轉速為13000g·min^-1，進行細胞代謝物的提取；

(3)樣品質譜分析：對收集的各組大鼠胰島素瘤細胞樣品進行方法學考察，建立超高液相色譜-串聯質譜技術檢測分析大鼠胰島素瘤細胞樣品指紋圖譜分析方法，對細胞樣品依次進行超高液相色譜-質譜分析；

超高液相色譜分析條件：采用Waters公司超高壓液相色譜系統進行檢測，HSS T3色譜柱,色譜柱規格為100mm×2.1mm，固定相粒徑1.8μm，柱溫37℃，流動相A乙腈，B 0.1％甲酸水，梯度洗脫：0～3min，3％A；3～8min，3～13％A；8～12min，13～20％A；12～17min，20～35％A；17～22min，35～60％A；22～30min，60～95％A；30～32min，95％A；32～34min，95～3％A；34～36min，3％A。流速為0.4mL·min^-1，進樣量3μL；

質譜條件：應用Waters MS公司高精度的三重四級桿質譜進行檢測，其條件為電噴霧離子ESI源，正離子模式下掃描：毛細管電壓3.0kV，離子源溫度120℃，脫溶劑氣溫度350℃，錐孔電壓40V，離子能量1.0V錐孔氣流量50L·h^-1，脫溶劑流量600L·h^-1，在碰撞能量為4eV情況下掃描時間為0.5s，間隔掃描時間0.02s；準確質量測定采用亮氨酸-腦啡肽溶液為鎖定質量溶液；掃描范圍m/z 50～1000，以Centriod模式進行數據采集，對九個樣品重復進樣六針，考察重現性，確保獲得可靠數據；

(4)數據預處理：采用Waters公司的Masslynx軟件進行去噪音、質譜峰提取、峰排列、峰對齊及歸一化等處理，得到各個峰的峰高或者峰面積及保留時間等數據；

(5)利用多元變量統計分析并篩選潛在生物標志物：在獲得超高液相色譜-串聯質譜數據后，采用SIMCA-P12.0軟件對導入的數據對對照組、棕櫚酸模型組、甜茶素干預組三組樣本進行主成分分析和偏最小方差判別分析；主成分分析作為無監督式學習方法，可以真實反映樣本的聚類情況，棕櫚酸誘導組與空白對照組分離良好，無交叉和重疊，說明兩組代謝模式存在明顯的差異；甜茶素組介于與空白組和棕櫚酸誘導模型組之間，更靠近空白組，提示甜茶素干預后大鼠胰島素瘤細胞代謝模式出現改變，表明甜茶素對棕櫚酸誘導的大鼠胰島素瘤細胞的代謝紊亂有一定的干預作用；進一步采用有監督式方法進行建模分析，所建模型變量的擬合能力指數R²Y為0.974,模型的預測指數Q2_cum為0.955，模型的參數R²Y表示模型的解釋率，Q2_cum表示模型的預測率；空白對照組和棕櫚酸誘導模型組大鼠胰島素瘤細胞的偏最小方差分析PLS-DA載荷圖中的每一個點代表一個變量，變量對分類的重要程度由變量重要性投影的大小來衡量，并依據其對變量進行篩選；采用SPSS16.0軟件進行統計學處理，選擇變量重要性投影值>1且具有統計學意義的變量作為潛在生物標志物；基于超高液相色譜-串聯質譜技術的大鼠胰島細胞瘤細胞PLS-DA得分圖表示主成分分析PCA得分圖，圖中每一個點代表一個樣品，棕櫚酸誘導組與空白對照組分離良好，無交叉和重疊，說明兩組代謝模式存在明顯的差異；甜茶素組介于與空白組和棕櫚酸誘導模型組之間，更靠近空白組，提示甜茶素干預后大鼠胰島素瘤細胞代謝模式出現改變，表明甜茶素對棕櫚酸誘導的大鼠胰島素瘤細胞的代謝紊亂有一定的干預作用；按基于超高液相色譜-串聯質譜技術的大鼠胰島細胞瘤細胞PLS-DA得分圖的結果，使用SPSS統計軟件進行偏最小方差分析PLS-DA得到空白對照組和棕櫚酸誘導模型組大鼠胰島細胞瘤細胞的偏最小方差分析PLS-DA載荷圖，能夠突顯出空白組和棕櫚酸誘導組差異的最大化合物，可被認為是與脂毒性相關的潛在標志物；

(6)潛在生物標志物的鑒定：根據變量對應的保留時間和分子量，檢索公共數據庫KEGG、HMDB和METLIN對潛在生物標志物進行鑒定，并與文獻進行比較，最終鑒定了十二個與脂毒性相關的差異代謝產物：溶血卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、神經酰胺、神經節苷脂GA2、神經節苷脂GM2、鞘氨醇、磷脂酸、前列腺素、磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷脂，其中溶血卵磷脂、神經節苷脂GA2、神經節苷脂GM2和磷脂酰乙醇胺上調，磷脂酰絲氨酸、心磷脂、神經酰胺、鞘氨醇、磷脂酸、前列腺素、磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷脂下調；

(7)差異代謝物的分析：將篩選鑒定出的差異代謝產物上傳到metaboanalyst在線分析軟件，采用細胞代謝物數據庫進行代謝物匹配，對甜茶素干預后的大鼠胰島細胞瘤細胞受影響顯著的代謝通路進行富集分析和拓撲分析，構建分析代謝通路圖；在構建的代謝通路圖中，四條代謝通路上的基因和酶形成相互交錯的網絡，通過代謝通路分析后所得影響值，當影響值大于0.5時，該條代謝通路在代謝網絡中具有重要影響，在使用metaboanalyst平臺進行分析的代謝通路總結圖中，依據代謝通路的p值和通路重要值確定甘油磷脂代謝通路、鞘脂代謝通路和花生四烯酸代謝通路和磷脂酶D通路均與脂毒性相關，甜茶素干預大鼠胰島細胞瘤細胞后起效最為相關的是甘油磷脂代謝通路；在四個代謝通路中所涉及的酶和基因網絡聯系圖中，有二十三個酶和二十八個基因參與了脂毒性的形成。