[發明專利]一種用于煙草基因編輯素材中硝酸鹽的高通量連續流動分析方法

在審

• 申請號: 201810146828.6
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108627665A
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發明（設計）人: 黃海濤;許永;李雪梅;李晶;孔維松;王晉;劉欣;楊葉昆;向海英;曾婉俐;許力;張建鐸;鄧樂樂;蔣佳芮;楊光宇
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: G01N35/10
• 分類號: G01N35/10;G01N35/02
• 代理公司: 北京市領專知識產權代理有限公司 11590
• 代理人: 楊兵

本發明公開了一種用于煙草基因編輯素材中硝酸鹽的高通量連續流動分析方法，包括以下步驟：A、準確稱取0.25g含有硝酸鹽的樣品置于25mL樣品管中，將稱好樣的進樣管依次放到連續流動分析儀自動進樣器的進樣盤上，直至全部放滿；B、用移液槍向每個樣品管中分別加入去離子水25mL，然后依次插入底部帶有0.45μm孔徑的過濾篩板的內套管，防止振蕩萃取過程中溶液濺出，插好內套管后把樣品盤放到振蕩器上，進行振蕩萃取；C、萃取完后把內套管下壓，讓萃取好的樣品溶液通過所述過濾篩板進入到內套管中，再把樣品盤放置到連續流動分析儀的自動進樣器上，自動進樣器的進樣針每次僅插入到內套管中的上清液處以吸取過濾好的樣品，轉入連續流動分析儀中進行分析。

技術領域

本發明屬于煙草化學研究領域，具體涉及一種適合煙草基因編輯素材中硝酸鹽含量檢測的高通量分析方法。

背景技術

隨著煙草行業“煙草基因組計劃重大專項基于基因組編輯技術的工廠化育種方案”的推進，以所有基因編輯素材為對象，通過化學成分分析對素材進行篩選，并通過煙葉的配伍性測試和卷煙配方驗證，確定工業可用性強的品種，成為了煙草行業迫切需求的關鍵技術內容。

煙草中的硝酸鹽與煙氣中的許多有害物質如氮氧化物、氰化氫、兒茶酚等生成量有關,硝酸鹽還是煙氣中致癌物質N亞硝胺的前體物。因此，測定煙草中的硝酸鹽有十分重要的意義。目前煙草中硝酸鹽的檢測常用連續流動分析法。連續流動分析技術將標準工作液、試樣、試劑按比例泵入化學分析器中，并同時定時送入氣體，使管路中形成連續流體分隔系統，使參與反應的物質在連續流動的過程中充分混合，然后經過一系列反應如混合、加熱、過濾等，最后通過檢測器檢測得到相應的峰值電信號，再通過標準曲線自動計算得到相應的濃度。連續流動分析技術具有檢測速度快、樣品和試劑用量少等優點，在國內外煙草行業得到了廣泛應用。

在目前煙草常規化學成分分析的標準方法(YC/T 296-2009)中，硝酸鹽的測定采用去離子水萃取樣品，然后再用連續流動分析儀進行測定。在樣品前處理過程中，需將樣品稱取至磨口三角瓶中，加入萃取劑振蕩萃取，用定性濾紙過濾，然后再將濾液轉移至連續流動分析儀的進樣管中，然后才能進行后續測定。在過濾的過程中，需將提取瓶中固體樣品殘渣與提取液的混合物傾倒于瓶口放置有定性濾紙折疊的漏斗中，將濾后的提取液收集在收集瓶中。樣品前處理過程中需幾次轉移樣品，不夠簡便，影響檢測的工作效率；而且轉移過程中可能會因引入雜質和提取液的不小心潑灑等影響到檢測結果的可靠性。

基因編輯工廠化育種至少會產生數萬個編輯素材，目前硝酸鹽樣品分析的日樣品處理量只有60個左右，完成數萬個素材的常規化學成分分析需要很長周期，分析結果的滯后將會影響到整個工廠化育種的進度，因此在基因編輯育種過程中對準確可靠的高通量快速分析方法的需求非常迫切。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基因編輯素材硝酸鹽測定的快速樣品前處理方法，包括以下步驟：

A、準確稱取0.25g含有硝酸鹽的樣品置于25mL樣品管中，從連續流動分析儀自動進樣器上取下進樣盤，將稱好樣的進樣管依次放到連續流動分析儀進樣盤上，直至將該進樣盤中的100個樣品管位全部放滿樣品管；

B、用25mL的移液槍向每個樣品管中分別加入去離子水25mL，然后依次插入底部帶有0.45μm孔徑的過濾篩板的內套管，防止振蕩萃取過程中溶液濺出，插好內套管后把樣品盤放到振蕩器上，按標準方法選定的振蕩萃取條件進行振蕩萃取；

C、萃取完后把樣品管的內套管下壓，讓萃取好的樣品溶液通過所述過濾篩板進入到內套管中，再把樣品盤放置到連續流動分析儀的自動進樣器上，自動進樣器的進樣針每次僅插入到內套管中的上清液處以吸取過濾好的樣品，轉入連續流動分析儀中進行分析。