[發明專利]一種檢測柯薩奇病毒的熒光定量PCR引物、探針、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201810145257.4
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108315477A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 鐘柏茂;陸小梅;彭琪;黎四平;蔣再學;李文瑞
• 申請（專利權）人: 東莞市第八人民醫院;東莞市兒科研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 東莞市華南專利商標事務所有限公司 44215
• 代理人: 姜華

1.一種檢測柯薩奇病毒的熒光定量PCR引物，其特征在于：所述引物的序列如下：

Coxsackievirus A6-VP1F：5’-TTCGGGTGTACATGAGAATTAAG-3’

Coxsackievirus A6-VP1R：5’-CGCCTTCATAATCCGTGGTGGTT-3’。

2.一種檢測柯薩奇病毒的熒光定量PCR探針，其特征在于：所述探針的序列如下：

Coxsackievirus A6-VP1P：5’-TTGGGTACCTAGACCCCTTC-3’。

3.根據權利要求2所述的一種檢測柯薩奇病毒的熒光定量PCR探針，其特征在于：所述探針的5’端用熒光基團標記，3’端用淬滅基團標記。

4.根據權利要求3所述的一種檢測柯薩奇病毒的熒光定量PCR探針，其特征在于：所述熒光基團為FAM、VIC、CY5或JOE中的一種，所述淬滅基團為BHQ或ECLIPSE中的一種。

5.一種檢測柯薩奇病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括權利要求1所述的引物和權利要求2-4任一項所述的探針。

6.一種用于非治療目的的采用權利要求5所述的試劑盒檢測柯薩奇病毒的熒光定量PCR方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)取待測樣品，采用磁珠法提取病毒RNA；

(2)用紫外分光光度計測定A260對標準品定量，對濃度為10⁸拷貝/mL標準陽性模板進行10倍的系列稀釋，制備濃度分別為10⁸拷貝/mL、10⁷拷貝/mL、10⁶拷貝/mL和10⁵拷貝/mL的陽性標準品；將待測樣品的病毒RNA、同樣量的陰性標準品和系列稀釋的陽性標準品分別加入到PCR反應體系中用熒光定量PCR儀進行PCR檢測；

(3)通過比較待測樣品和相應標準品的Ct值，對待測樣品的起始拷貝數進行定量。

7.根據權利要求6所述的一種用于非治療目的的檢測柯薩奇病毒的熒光定量PCR方法，其特征在于：所述步驟(1)具體為：

A、樣品處理：將待測樣品在超凈工作臺轉入無酶EP管中，加入1mL裂解液，并旋渦振蕩至無明顯顆粒物，室溫靜止4-6min。

B、分離RNA層：向EP管中加入180-220μL氯仿，蓋緊EP管蓋，用力振蕩混合溶液至乳濁液，室溫靜止4-6min；在3-5℃溫度下以10000-14000g離心力離心8-12min；從離心機中取出EP管，內部勻漿液分為三層，吸取最上層無色溶液并轉移到新的EP管中；

C、核酸結合：向EP管中加入350-450μL異丙醇和15-25μL提前搖晃均勻的磁珠懸浮液，高速旋渦振蕩4-6min；

D、磁性分離：將EP管置于磁力架上靜置15-25s至磁珠吸附完全，如果EP管中有磁珠殘液，可保持EP管在磁力架上，整體上下顛倒2-3次使磁珠吸附完全，然后去上清液。

E、一次清洗：向EP管中加入600μL清洗液A，用移液槍吹散磁珠，旋渦振蕩1.5-2.5min，參照步驟D進行磁性分離；

F、二次清洗：使用600μL清洗液B，參照步驟E操作兩次；

G、洗脫：將棄盡上清液的EP管保持于磁力架上，打開EP管室溫晾干6-10min至無明顯乙醇味；向EP管中加入30-100μL洗脫液，旋渦振蕩至磁珠全部分散于液相中，56-60℃溫浴4-6min；洗脫完畢后，用移液槍將洗脫液轉移至另一干凈EP管中，將所提取的RNA反應液置于超低溫冰箱待用。