[發明專利]艾滋病治療藥物NRTIs耐藥突變位點D30N的引物及其應用

在審

• 申請號: 201810144210.6
• 申請日: 2018-02-11
• 公開（公告）號: CN108179184A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 梁浩;蔣俊俊;葉力;臧寧;余軍;陳榮風;楊全略;黃頡剛;寧傳藝;廖艷研;梁冰玉
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

本發明公開了檢測艾滋病核苷類逆轉錄酶抑制劑主要耐藥突變位點D30N的ASPCR引物，每個引物對均由上游特異序列和下游序列組成。據此，發明人還建立了相應檢測方法及試劑盒。應用本發明可檢測HIV?1病毒RNA的pol基因的270位氨基酸的堿基進行突變，設計的ASPCR引物只針對特定位點堿基突變序列，能特異性擴增突變模板，以有效檢測艾滋病低豐度耐藥，克服了基因型檢測方法實驗周期長、檢測豐度高的缺點。本發明只涉及real?time PCR檢測這一常見方法，易于掌握，操作快速，具有特異性強、靈敏度高、簡便快速、成本低等優點，根據PCR的擴增曲線和CT值即可判斷基因類型。

技術領域

本發明屬于PCR檢測技術領域，尤其涉及艾滋病治療藥物NRTIs耐藥突變位點D30N的引物及其應用。

背景技術

艾滋病自1981年發現以來，迅速在全世界蔓延，已成為危害人類健康的重大公共衛生問題。據UNAIDS報道，截至2016年11月30日，全國報告現存活艾滋病病毒(HIV)感染者/AIDS病人659 990例，報告死亡206 336例。現存活HIV感染者383 983例，AIDS病人276 007例。

高效抗逆轉錄病毒治療已廣泛應用于艾滋病患者的臨床治療，目前約有1560萬艾滋病病毒感染者接受抗逆轉錄病毒治療，極大地提高了患者的生存率。然而，抗病毒治療的人數及地區的快速擴大也導致艾滋病耐藥毒株的傳播和流行。我國不同地區抗病毒治療人群耐藥發生率從3％到56％不等。

對于艾滋病初治患者，抗病毒治療方案為2種核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTIs)+1種非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)或2種NRTIs+1種蛋白酶抑制劑(PIs)，分別以HIV病毒pol基因上的逆轉錄酶和蛋白酶為靶標。艾滋病的耐藥發生在艾滋病病毒pol基因(SEQ.ID.NO.7)上，主要分為NRTIs耐藥突變、NNRTIs耐藥突變和PIs耐藥突變。其中PIs藥物有沙奎那韋，利托那韋，茚地那韋，奈非那韋，安普那韋和洛匹那韋等，可誘導產生D30N、I54V、G73C等耐藥突變。

病毒耐藥是導致治療失敗的主要原因之一，采用經濟高效的耐藥檢測方法，及時了解HIV治療患者的耐藥性，對于提高艾滋病治療效果和控制艾滋病疫情有重要意義。臨床上廣泛使用的耐藥檢測方法是基于測序的基因型檢測，包括直接測序法、克隆測序分析、連續特異性擴增分析、深度焦磷酸測序等。這些方法雖然操作較為簡單，但缺點明顯，如檢測時間長、費用高等。

等位基因特異性PCR(ASPCR)是一種快速、準確、低成本的檢測單堿基突變的技術。通過設計引物，使引物的3’末端倒數第二位堿基與突變位點配對，且可在3’末端倒數第三位自造堿基錯配以試圖提高引物特異性。進行PCR時，模板正確匹配的引物正常擴增，而與模板錯誤配對的引物沒有擴增產物，從而確定序列的基因型。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供特異性強的艾滋病治療藥物NRTIs耐藥突變位點D30N的引物及其應用。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

艾滋病治療藥物NRTIs耐藥突變位點D30N的引物，為引物對一、引物對二或引物對三，每個引物對均由上游特異序列和下游序列組成；引物對一的上游特異序列和下游序列分別具有序列表SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的堿基序列；引物對二的上游特異序列和下游序列分別具有序列表SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4的堿基序列；引物對三的上游特異序列和下游序列分別具有序列表SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.6的堿基序列。

上述引物在檢測艾滋病治療藥物核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變位點D30N中的應用。

艾滋病治療藥物核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變位點D30N的ASPCR檢測方法，采用前述引物，針對D30N位點突變以待檢測樣品的cDNA為模板進行PCR擴增。