[發明專利]豬圓環病毒2d型病毒樣顆粒疫苗及其制備方法

在審

• 申請號: 201810144099.0
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108355131A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 楊毅;王東亮;王乃東;鄒亞文;雷昕諾;湛洋;余婉婷;董彥鵬
• 申請（專利權）人: 江蘇南農高科技股份有限公司;美國普賽（PROCELL）生物高科技有限責任公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/20;C12N15/70;C12N15/34
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所(普通合伙) 11305
• 代理人: 鄭明

本發明涉及豬圓環病毒2d型病毒樣顆粒疫苗及其制備方法。本發明通過對我國PCV2d毒株流行病學的分析，通過對所收集大量的毒株氨基酸序列信息比對和系統進化樹分析，選取了一株我國當前流行的PCV2d毒株的Cap基因，通過密碼子序列優化，采用大腸桿菌原核表達系統高效表達了PCV2d Cap蛋白，經純化及體外組裝透析緩沖液中進行組裝，成功的制備了PCV2d病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒在本發明的保存緩沖液中于4℃和?20℃放置6個月不影響病毒樣顆粒的形態、大小及濃度；制備好的PCV2d病毒樣顆粒疫苗免疫21日的仔豬，經PCV2d病毒攻毒測試，證明該疫苗能對仔豬起到很好的保護作用。

技術領域

本專項發明內容包括豬圓環病毒2d型(PCV2d)病毒樣顆粒(virus likeparticles，VLPs) 的制備方法、成功透析組裝成VLPs的體外組裝緩沖液(buffer)、VLPs長期保存buffer的試 劑配方及PCV2d VLPs組裝效率的評價體系，制備的病毒樣顆粒疫苗用于預防豬圓環病毒2d 型疾病的感染，屬于獸用生物制品領域。

背景技術

1991年豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV 2)首次在加拿大的豬群中分離得 到，目前PCV2的基因型分為：PCV 2a、PCV 2b、PCV 2c、PCV 2d(mPCV 2b)，PCV2c目 前僅在丹麥報道。最初PCV2a是流行的主要基因型，直到2003年，PCV2的主要流行毒株的基因型發生了由PCV 2a向PCV 2b的轉變。2010年國內首次報道發現了變異的PCV 2毒株，命名為突變的PCV 2b毒株(mutant PCV 2b，mPCV 2b)，之后研究者根據遺傳進化樹分析遺傳距離超過0.035，而被命名劃分為PCV2d，與PCV2b的毒株同源性極高，由于ORF2 第1033-1035核苷酸的突變，導致編碼的病毒衣殼蛋白(Cap)C端多出一個帶正電荷的賴氨酸。之后國內外陸續報道PCV 2d的流行病學情況，現在PCV 2d已經逐漸成為流行的主導毒株。

研究發現，廣泛的疫苗接種能夠改變PCV 2的進化模式，從而可能導致出現具有逃避疫 苗免疫能力的PCV 2變異株。PCV 2具有迫于疫苗而進化以及疫苗誘導的病原替換的能力。 2003年主要流行毒株的基因型由PCV 2a向PCV 2b的轉變，以及2010年新基因型PCV2d 的出現并迅速流行的一個重要的原因是疫苗免疫誘導的選擇壓力。由于PCV 2d在C端延伸 一個帶正電荷的賴氨酸，改變了原有的構象型表位，而導致目前疫苗產生的抗體無法識別， 進一步造成免疫逃避，2012年美國首次報道了在免疫失敗的豬場分離得到PCV 2d，為了控 制豬圓環病毒相關疾病(PCVAD)，2014年韓國報道了在兩個分別免疫了商業化的PCV2疫 苗的豬場分離到PCV 2d，不能有效的防控PCV 2d的流行。

目前PCV 2d已經成為主要的流行毒株，PCV 2d的出現及迅速流行可能將對我國豬場疫 病防控產生強烈的影響。由于PCV 2各個基因型之間存在交叉免疫保護性，有相關研究報道 現有的PCV 2a/PCV 2b疫苗對新的變異毒株(PCV 2d)具有一定的保護效果，

發明內容

但由于現有豬圓環病毒疫苗與流行的新變異毒株不是最佳的匹配，保護效果不是十分理 想，PCV 2的遺傳變異多樣性及其快速的進化速率提示我們現有的疫苗已需要進行更新升級。 為此本發明的目的在于研發出以PCV2d新變異毒株為基礎的新型疫苗，將有利于更好地防控 目前流行的PCV 2d毒株。

本發明的技術方案