[發(fā)明專利]海藻酸裂解酶突變體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810143677.9
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN110144341B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許麗紅;石增秀;周利偉;黃亦鈞
• 申請（專利權(quán)）人: 青島蔚藍(lán)生物集團有限公司;濰坊康地恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
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本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海藻酸裂解酶突變體。本發(fā)明通過隨機突變的方法篩選獲得的海藻酸裂解酶突變體，其在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)水平得到顯著提高。重組表達(dá)野生型海藻酸裂解酶的枯草芽孢桿菌，其搖瓶發(fā)酵上清液酶活為488 U/ml，而重組表達(dá)海藻酸裂解酶突變體的枯草芽孢桿菌，其搖瓶發(fā)酵上清液高達(dá)635?780 U/ml，提高了30%?60%，取得了意料不到的技術(shù)效果。所述突變體的應(yīng)用將有利于降低海藻酸裂解酶的生產(chǎn)成本，市場前景廣闊。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海藻酸裂解酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

海藻酸是儲量僅次于纖維素的海洋生物多糖。海藻酸存在于海藻的細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)中，在褐藻中的含量最為豐富，大多數(shù)巨型褐藻是海藻酸的潛在來源。但不同種類的褐藻，其所含海藻酸的性質(zhì)不同，所以要根據(jù)褐藻的可用性及其海藻酸的性質(zhì)來選擇褐藻的來源。海藻酸主要的商業(yè)來源是泡葉藻、公牛藻、翅藻、海帶、巨藻、馬尾藻和喇叭藻，其中最重要的是海帶、巨藻和泡葉藻。全球海藻酸的產(chǎn)地主要分布于沿海國家和地區(qū)，如挪威、美國、法國、中國、日本和韓國。

目前，海藻酸降解的方法可分為三大類：一類是化學(xué)降解法，目前廣泛采用的是堿水解法，這種方法存在污染環(huán)境且能耗較大的不足，同時堿水解對海藻中的有效物質(zhì)有所破壞。此外，還有過氧化氫氧化降解法；第二類是物理降解法，例如超聲降解海藻酸；第三類是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸條件溫和，過程可控，得率高，綠色安全，環(huán)境友好，作用機理明確，產(chǎn)物確定，可以根據(jù)具體目的產(chǎn)物要求選擇單一或組合使用不同底物專一性的酶制劑。

海藻酸裂解酶通過β消去反應(yīng)裂解海藻酸的4-O-糖基鍵，同時在C-4和C-5之間形成雙鍵，在產(chǎn)生的寡糖的非還原端產(chǎn)生4-deoxy-L-erythro-hex-4-ene pyranosyluronate在230-240mm有強吸收峰。按底物的特異性，海藻酸裂解酶分為三種：第一種是聚甘露糖醛酸裂解酶，對polyM有特異性；第二種是聚古羅糖醛酸裂解酶，對polyG有特異性；第三種是對polyMG有特異性的裂解酶。按作用方式又可分為內(nèi)切海藻酸裂解酶和外切海藻酸裂解酶。

海藻酸裂解酶的來源廣泛，主要有三大類，第一類是微生物，如海洋細(xì)菌、土壤細(xì)菌、真菌等；第二類是海洋軟體動物和棘皮動物，如海螺、海參、鮑魚等；第三類是植物，如巨藻、泡葉藻、海帶等。

目前，海藻酸裂解酶的生產(chǎn)大多是依靠海藻酸分解菌。雖然野生型海藻酸分解菌能有效的獲得定量的酶蛋白，但產(chǎn)量很低成本較高，難達(dá)到實際應(yīng)用要求。因此，利用基因工程手段對海藻酸裂解酶基因進行異源表達(dá)是提高海藻酸裂解酶產(chǎn)量的最有效途徑。研究主要集中在海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因的克隆和在大腸桿菌中過表達(dá)。目前，已有二十多種海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因被克隆，而且其中大部分基因已成功地進行了異源表達(dá)。重組海藻酸裂解酶的表達(dá)量均高于野生菌株。1993年，Maki等研究人員，在大腸桿菌中表達(dá)了Pseudomonas sp. OS-AIG-9的海藻酸裂解酶，其重組酶活性是野生菌株的53倍。

近年來，隨著蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)在酶制劑領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，新型的酶活水平高、性質(zhì)優(yōu)良的海藻酸裂解酶的開發(fā)成為本領(lǐng)域的研究熱點，對于降低海藻酸裂解酶的生產(chǎn)成本，促進海藻酸裂解酶的產(chǎn)業(yè)化具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種新型的海藻酸裂解酶突變體，并構(gòu)建得到重組表達(dá)該突變體的枯草芽孢桿菌工程菌株。與野生型海藻酸裂解酶相比，所述海藻酸裂解酶突變體在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)水平得到明顯提高，有利于大幅降低該酶的生產(chǎn)成本，市場前景廣闊。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種海藻酸裂解酶突變體，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或（Ⅲ）所示的氨基酸序列中任意一個：

(Ⅰ) 與海藻酸裂解酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列；