[發明專利]抗埃博拉病毒VP40蛋白單克隆抗體G7A6及其應用

有效

• 申請號: 201810143428.X
• 申請日: 2018-02-11
• 公開（公告）號: CN108250293B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 姚航平;余東山;李蘭娟
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;G01N33/569
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

本發明公開了一種抗埃博拉病毒VP40蛋白單克隆抗體G7A6及其應用。該單克隆抗體亞型為IgG1、κ型，能與ZEBOV?VP40蛋白N端抗原肽特異性結合，發揮抗病毒效應；產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞SP2/0經融合、篩選、克隆和傳代流程篩選后獲得的雜交瘤細胞，能穩定分泌G7A6，抗體的重鏈氨基酸序列如SEQ ID No.1，輕鏈氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。G7A6具備拮抗扎伊爾型埃博拉病毒樣顆粒的抗病毒效應，可以其它單抗聯合應用。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及抗扎伊爾型埃博拉病毒VP40蛋白單克隆抗體的制備及應用，是利用細胞工程、抗體工程技術，獲得分泌抗VP40蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞系，通過同品系的小鼠誘導腹水，制備抗VP40蛋白的單克隆抗體G7A6，鑒定為IgG1、κ型，通過基因測序明確抗體的序列，再通過親和純化、電泳、免疫、基因工程等技術實現對該抗體的應用。

背景技術

埃博拉病毒病是由埃博拉病毒感染引起的致死性出血熱。1976年，埃博拉病毒首次在蘇丹南部和剛果（金）（舊稱扎伊爾）發現，后陸續在中非地區小規模爆發，截止2013年，共造成2387人發病，死亡1310例，病死率54.9%。2014年埃博拉病毒再次爆發，以扎伊爾型埃博拉病毒為主要毒株，席卷西非，并跨越大洲，美國、英國、西班牙相繼發生埃博拉病例。截止2016年12月31日，共報告28712例病例（含確診及可疑病例），死亡11372例，死亡率39.6%。盡管自西非疫情以來，針對埃博拉病毒快速診斷、抗病毒藥物、疫苗等研究等方面已經取得很大進展，但目前國際上仍沒有特異的治療手段和可供臨床推廣應用的疫苗。埃博拉病毒病已經成為國際性重大傳染病，研究抗埃博拉病毒治療對人類的安全至關重要。

研究表明，埃博拉病毒GP及VP40蛋白在埃博拉病毒病的致病機制中擔任重要作用，GP蛋白與病毒入侵、胞膜融合密切相關，VP40蛋白在促進膜融合，維持病毒顆粒完整性,協助病毒出芽等方面發揮重要作用。因此，GP及VP40蛋白是研究藥物、疫苗等的重要靶點。目前，有多種埃博拉病毒GP及VP40單克隆抗體得到鑒定，但多數用于快速診斷，僅有數個GP單克隆抗體在靈長類動物模型上驗證了抗病毒效應，譬如，GP單克隆抗體mAb114; 2個GP單克隆抗體的聯合抗體MIL77E；3個GP單克隆抗體的聯合：MB-003, ZMab 和 ZMapp^TM。當前，僅ZMapp^TM正在開展I/II期臨床試驗。但是具備抗埃博拉病毒效應的VP40單克隆抗體未見報道。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種抗埃博拉病毒VP40蛋白單克隆抗體G7A6及其應用。

一種抗埃博拉病毒VP40蛋白單克隆抗體G7A6，該單克隆抗體亞型為IgG1、κ型，能與ZEBOV-VP40蛋白loop區域抗原肽特異性結合，發揮抗病毒效應；產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞SP2/0經融合、篩選、克隆和傳代流程篩選后獲得的雜交瘤細胞，能穩定分泌G7A6，抗體的重鏈氨基酸序列如SEQ IDNo.1，輕鏈氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一種所述的單克隆抗體G7A6的制備方法，通過以下步驟獲得：

（1）小鼠免疫：選擇6周齡的BALB/C雄性小鼠，以針對ZEBOV-VP40蛋白loop區域的特異的抗原肽14肽 CTGKKVTSKNGQPI ，SEQ ID No.3，對小鼠進行免疫，總共免疫3次，第1次免疫予100μg抗原肽加佐劑混勻后予小鼠大腿內側肌肉注射免疫，第21天時，同等劑量抗原肽及佐劑混合物免疫第2次，第35天時，同等劑量抗原肽及佐劑混合物免疫第3次；第38天處理小鼠，用于融合實驗；

（2）小鼠骨髓瘤細胞的培養：培養小鼠骨髓瘤細胞SP2/0并使其保持良好的生長狀態用于雜交瘤細胞融合；