[發明專利]一種產木犀草素酵母菌株的基因合成方法及菌株和應用在審
| 申請號： | 201810141570.0 | 申請日： | 2018-02-11 |
| 公開（公告）號： | CN108315343A | 公開（公告）日： | 2018-07-24 |
| 發明（設計）人： | 張澤淵;王曉明;昝雪峰;馬鵬;羅永賢;張明;李光富;謝忠祥;張荷蘭;路則寶;李洪文;韓朝志;張志琴;尹書 | 申請（專利權）人： | 楚雄醫藥高等專科學校 |
| 主分類號： | C12N15/81 | 分類號： | C12N15/81;C12N15/66;C12N1/19;C12P17/06;C12R1/865 |
| 代理公司： | 昆明知道專利事務所(特殊普通合伙企業) 53116 | 代理人： | 謝喬良;張玉 |
| 地址： | 675000 云南省楚雄彝*** | 國省代碼： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 木犀草素 重組菌株 整合 酵母菌株 釀酒酵母基因組 基因合成 重組載體 克隆 菌株 基因 基因組cDNA 穿梭質粒 基因擴增 基因融合 綠色環保 片段整合 引物擴增 質粒構建 培養基 燈盞花 啟動子 缺陷型 同源臂 終止子 染色體 得率 位點 引物 應用 合成 篩選 經營 | ||
1.一種產木犀草素酵母菌株的基因合成方法，其特征在于包括燈盞花組織DNA提取、釀酒酵母菌基因克隆、重組載體構建、基因重組、可溶性融合蛋白整合、篩選步驟，具體步驟如下：
A、燈盞花組織DNA提取：按常規方法獲取燈盞花基因組cDNA，將燈盞花基因組cDNA經引物設計克隆得到苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羥基化酶、對香豆酸-coA連接酶、查爾酮合酶、查爾酮異構酶和類黃酮合成酶Ⅱ的編碼基因；
B、釀酒酵母菌基因克隆：按常規方法從釀酒酵母基因組中克隆得到乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶、乙酰輔酶A合酶和乙酰輔酶A羧化酶1的編碼基因；
C、重組載體構建：利用Golden gate克隆技術，分別將A步驟及B步驟得到的基因及由設計好的引物擴增得到的啟動子質粒和終止子質粒，共同構建含有基因P1、ALD6、ACS和T1的T1重組載體，基因P2、ADH2、ACCI和T2的T2重組載體，基因P1、PAL、4CL和T3的T3重組載，基因P2、C4H、CHI和T4的T4重組載體，基因P1、CHS、FSⅡ和T5的T5重組載體；
D、基因重組：利用常規酵母基因組整合方法將C步驟得到的五個重組載體的雙向基因擴增片段整合到釀酒酵母基因組W303的常規整合位點內部，得到產芹菜素的重組菌株；
E、可溶性融合蛋白整合：將類黃酮-3'-羥化酶、細胞色素還原酶基因經融合后與穿梭質粒YCplac22重組，將重組后的穿梭質粒通過同源臂整合到D步驟得到的重組菌株染色體內，得到整合重組菌株；
F、篩選：將E步驟得到的整合重組菌株經過營養缺陷型培養基CM-Trp篩選，得到產木犀草素的酵母菌株。
2.根據權利要求1所述產木犀草素酵母菌株的基因合成方法，其特征在于所述A步驟中的苯丙氨酸解氨酶為PAL，所述肉桂酸4-羥基化酶為C4H，所述對香豆酸-coA連接酶為4CL，所述查爾酮合酶為CHS，所述查爾酮異構酶為CHI，所述類黃酮合成酶Ⅱ為FSⅡ；所述B步驟中的乙醇脫氫酶為ADH2，所述乙醛脫氫酶為ALD6，所述乙酰輔酶 A 合酶為ACS，所述乙酰輔酶A羧化酶1為ACCI；所述E步驟中的類黃酮-3'-羥化酶為F3’H，所述細胞色素還原酶為CPRI。
3.根據權利要求2所述產木犀草素酵母菌株的基因合成方法，其特征在于所述A步驟包括下述分步驟：
A1、向研磨好的粉末狀燈盞花組織樣品中加入10倍體積的RLT和1倍體積的PLANTaid，室溫下迅速攪拌成勻漿后裝入離心管劇烈搖晃振蕩13～17s，然后經13000rpm離心5～10min，得到上清液；
A2、取上述上清液并加入上清液體積一半的無水乙醇后立即吹打混勻，將混勻的混合物加入基因組清除柱并置于收集管中，經離心至離心管內液體全部濾過且膜上無殘留，棄掉濾液；
A3、將上述離心后的基因組清除柱放入離心管內，在基因組清除柱內加入裂解液RLTPlus，然后13000rpm離心30s，得到收集濾液，然后加入0.5倍體積的無水乙醇并立即吹打混勻，將混勻的混合物加入吸附柱RA并置于收集管中，經離心至離心管內液體全部濾過且膜上無殘留，棄掉濾液；
A4、將上述離心后的吸附柱RA加入去蛋白液RW1，室溫放置1min，然后經13000rpm離心30s，棄掉廢液，再加入漂洗液RW，經13000rpm離心30s，棄掉廢液；
A5、將A4得到的吸附柱RA放回空收集管中，經13000rpm離心去除漂洗液，然后將吸附柱RA放入RNAase free離心管中，在吸附膜的中間部位加入RNAase free water并室溫放置1min，最后經12000rpm離心1min；
A6、如果預期RNA產量＞30μg，向吸附膜的中間部位加30～50μl的RNase free water并重復分步驟A5，合并兩次洗液或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復分步驟A4一遍，得到燈盞花總RNA；
A7、以上述燈盞花總RNA為模板參照RevertAidTM Fist Stand cDNA Synthesis Kit方法反轉錄合成第一鏈cDNA，終反應在70℃金屬浴保持5min，最后依照DNA純化試劑盒操作流程進行純化，得到燈盞花基因組cDNA。
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