[發明專利]用于檢測獼猴桃軟腐病原菌的引物及檢測方法和應用

在審

• 申請號: 201810138694.3
• 申請日: 2018-02-10
• 公開（公告）號: CN108315461A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 胡容平;石軍;陳松;葉慧麗;陳慶東;林立金
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院植物保護研究所;綿陽市農業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 成都帝鵬知識產權代理事務所(普通合伙) 51265
• 代理人: 黎照西

1.一種高靈敏性檢測獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的一組特異性引物，其特征在于，所述一組特異性引物由正向引物和反向引物組成，所述正向引物為：5＇-TCATTCGTGATCTCAAGCCAGA-3＇如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物為：5＇-TGCTGGTGAAGATAGACATCTGC-3＇，如SEQ ID NO.2所示；

所述一組特異性引物的檢測靈敏度為1pg菌體DNA或者200CFU Botryosphaeriadothidea。

2.一種獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的高靈敏度檢測方法，其特征在于，所述方法包括步驟：

(1)從獼猴桃果品中提取DNA；

(2)以步驟(1)所得DNA為PCR模板DNA，進行PCR擴增；

(3)用瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟(2)所得擴增產物，如產生目標大小條帶，則證明獼猴桃果品感染軟腐病；

步驟(2)中，進行所述PCR擴增時，所用的引物由正向引物和反向引物組成，所述正向引物為：5＇-TCATTCGTGATCTCAAGCCAGA-3＇如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物為：5＇-TGCTGGTGAAGATAGACATCTGC-3＇，如SEQ ID NO.2所示。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，提取DNA的方法為CTAB法。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述CTAB法的步驟為：

1)取適量的獼猴桃果品放入1.5ml EP管中，加入液氮后，用研磨棒快速研磨成粉末；

2)加入550μL 65℃預熱的CTAB提取液，劇烈振蕩后，放于65℃恒溫箱中1h，其間間隔10min振蕩混勻一次

3)加入550μL氯仿-異戊醇，劇烈震蕩并充分混勻，靜置10min，于13000r/min轉速下離心5min；

4)取上清，加入600μL冰乙醇，于13000r/min轉速下離心5min，倒掉上清，用75％乙醇沖洗沉淀；重復該步驟至少1次；

5)于7500r/min轉速下空離心3min，用移液器吸去底部多余的液體，放于室溫自然干燥；

6)干燥后，加入適量的滅菌ddH₂O充分溶解，然后保存于-20℃備用。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，進行所述PCR擴增時，所用的PCR反應體系包括10×PCR buffer、dNTP Mixture、模板DNA、Ex Taq、ddH₂O和所述引物。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR反應體系為：PCR模板DNA：1.0μL、2.0mM的dNTP Mixture：2.0μL、10×PCR buffer：2.0μL、10mM的正向引物：0.5μL、10mM的反向引物：0.5μL、5units/μL的Ex Taq：0.1μL、加入ddH₂O至PCR反應體系體積為20μL。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的程序為：

1)于94℃進行模板DNA的預變性反應，反應時間為4min；

2)于94℃進行模板DNA的變性反應，反應時間為30s；

3)于60℃進行退火，時間為30s；

4)于72℃下進行延伸，時間為1min；

5)循環步驟1)～4)30次；

6)于72℃延伸5min；

7)對擴增產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳成像分析。

8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述特異性目標條帶的位置為703bp處。

9.權利要求2～7任一項所述方法在檢測由Botryosphaeria dothidea引起的獼猴桃軟腐病上的應用。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述應用包括對獼猴桃種苗檢疫、土壤病原菌檢測、獼猴桃軟腐病早期病害診斷以及Botryosphaeria dothidea的檢測和鑒定。