[發(fā)明專利]一種能同時表達(dá)CD19 CAR和敲低T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及其構(gòu)建方法

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• 申請日: 2018-02-10
• 公開（公告）號: CN108424927A
• 公開（公告）日: 2018-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張同存;顧潮江;潘麗娟
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢波睿達(dá)生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 北京匯澤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 張濤

本發(fā)明涉及一種能同時表達(dá)CD19CAR和敲低T細(xì)胞表面PD?1表達(dá)的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，包括依次串聯(lián)的H1啟動子、由H1啟動子啟動的抗PD?1shRNA序列、EF1α啟動子以及由EF1α啟動子啟動的三代CD19CAR序列；所述三代CD19CAR序列由CD19單鏈可變區(qū)、人CD8α鉸鏈區(qū)、人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、人41BB胞內(nèi)區(qū)、以及人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)串聯(lián)構(gòu)成。本發(fā)明所提供的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，將其用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)T細(xì)胞，比采用CRISPR/Cas9敲除PD?1在生產(chǎn)CART細(xì)胞的工藝上簡化了很大一步；并且這些CART細(xì)胞在體外受到抗原刺激后表現(xiàn)出了殺腫瘤細(xì)胞毒性的增強，細(xì)胞持久性的修復(fù)以及細(xì)胞因子分泌能力的上升。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能同時表達(dá)CD19 CAR和敲低T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及其構(gòu)建方法。

技術(shù)背景

美國食品和藥物管理局(FDA)在2017年8月30日批準(zhǔn)了第一個基因治療，他們批準(zhǔn)了Kymriah(tisagenlecleucel)治療一些患有急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的兒童和年輕成人患者。Kymriah是一種基因改良的自體T細(xì)胞免疫療法，即嵌合抗原受體T細(xì)胞(CART)免疫療法。最常見的CARs包括了一段抗原識別序列，比如一段單克隆抗體(mAb)的單鏈可變區(qū)片段(scFv)，以及主要來自于激活T細(xì)胞胞內(nèi)信號域的TCRζ鏈(Lee DW,Barrett DM,MackallC,Orentas R,Grupp SA.The Future Is Now:Chimeric Antigen Receptors as NewTargeted Therapies for Childhood Cancer.Clin Cancer Res.2012；18(10):2780-2790.doi:10.1158/1078-0432.CCR-11-1920.)。靶向CD19的CART細(xì)胞已經(jīng)在臨床前和臨床實驗中表現(xiàn)出了十分有希望的結(jié)果，并且已經(jīng)證明他們在具有難治性和復(fù)發(fā)性的b-前體急性淋巴細(xì)胞性白血病兒童和青少年中進(jìn)行的有效抗白血病效應(yīng)是安全可行的，所有的毒性可逆并且沒有發(fā)生持續(xù)的B細(xì)胞發(fā)育不全(Lee DW,Kochenderfer JN,Stetler-StevensonM,et al.T cells expressing CD19chimeric antigen receptors for acutelymphoblastic leukaemia in children and young adults:A phase 1 dose-escalation trial.Lancet.2015；385(9967):517-528.doi:10.1016/S0140-6736(14)61403-3)。

然而，在治療另一些血液腫瘤比如慢性淋巴細(xì)胞白血病和實體瘤方面還有很多的問題沒有解決。腫瘤微環(huán)境在抑制和增強免疫應(yīng)答方面具有十分重要的作用，為了能夠消除腫瘤細(xì)胞，需要免疫系統(tǒng)的激活，效應(yīng)細(xì)胞的擴增和激活效應(yīng)細(xì)胞浸潤到組織里面，才能消滅腫瘤細(xì)胞。而效應(yīng)T細(xì)胞會被腫瘤微環(huán)境中的免疫檢查點分子抑制，比如程序性死亡受體(PD-1).PD-1在急性髓細(xì)胞性白血病(AML)中與CART細(xì)胞的耗竭和機能障礙有關(guān)4,而PD-1的封閉能夠在體外增強T細(xì)胞的生存和毒性，PD-1/PD-L1的結(jié)合反應(yīng)可能是誘導(dǎo)活化導(dǎo)致的細(xì)胞死亡(AICD)產(chǎn)生的分子機制之一，并限制了CART細(xì)胞在體內(nèi)的持續(xù)存在(GargettT,Yu W,Dotti G,et al.GD2-specific CAR T cells undergo potent activation anddeletion following antigen encounter but can be protected from activation-induced cell death by PD-1 blockade.Mol Ther.2016；24(6):1135-1149.doi:10.1038/mt.2016.63.)。