[發明專利]一種純化抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體的方法

有效

• 申請號: 201810135774.3
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN110128538B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發明（設計）人: 張貴民;趙麗麗;張義才
• 申請（專利權）人: 魯南制藥集團股份有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K1/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于醫藥領域，涉及到單克隆抗體純化技術，具體公開了一種離子交換層析純化抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體的方法。本發明通過將離子交換層析過程中加入添加劑，并用鹽調節電導顯著改善了層析性能，提高了蛋白質量，降低蛋白濁度。通過本發明的技術方案，可使得目的蛋白純度達到了99.7％以上，同時酸堿異構體、其他雜質成分和含量很好的控制在抗體的質量要求之內。本發明操作簡單，成本低廉，安全性高，可用于工業化大規模生產。

技術領域

本發明屬于醫藥領域，涉及到單克隆抗體的純化技術，具體涉及一種離子交換層析純化抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體的方法。

背景技術

CD20是非糖基化的跨膜磷酸蛋白，表達在大多數成熟B細胞表面，分化為漿細胞后，CD20消失。研究表明它可以起到鈣離子通道的作用，參與B細胞分化、發育的調節。而在B細胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的表達量異常增高，與在抗體結合后，CD20不被內在化或從細胞膜上脫落。CD20的上述特點使其成為利用單克隆抗體治療B細胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(NHL)的理想靶抗原。針對這一優勢，開發研制了一種抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體，其在與B細胞淋巴瘤表面的抗原結合后，可通過激活補體介導的細胞溶解及細胞毒作用從而破壞和清除腫瘤細胞。

采用重組技術，應用CHO細胞表達系統，可以獲得大規模的抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體，但細胞環境的多樣性和培養細胞補料的加入使得獲得的抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體中的雜質多樣，主要包括宿主殘留蛋白(HCP)核酸、酸堿異構體等，微量的雜質都會在人體內產生免疫反應，因此必須使抗體中的雜質成分和濃度控制在抗體的質量要求之內。雜質的去除適于純化階段，優化純化工藝，提高純化效率在抗體類藥物生產中至關重要。

抗體藥物的制造又以下游工藝最為復雜繁瑣。下游工藝包含多個步驟，目前常用的是親和層析、疏水層析、陽離子交換層析和陰離子交換層析的液相色譜分離方法。雖然都是采用這幾種層析方法，但是具體的參數不同、填料選擇不同都會產生完全不同的效果。

層析方法中粗純的親和層析柱可以通過抗體與Fc融合蛋白吸附的特異性從而吸附目的抗體而除去90％以上的細胞上清中的雜質，因此在蛋白A親和層析之后還需要進行多維純化的工藝優化。針對于親和層析獲得的抗體CD20人鼠嵌合單克隆抗體異構體、DNA的殘留多等問題，對其后續的陽離子陰離子層析進行工藝優化，以求獲得高質量的抗體，保證用藥安全。

CN105017418A公開了一種單克隆抗體的純化方法，(1)親和層析，(2)調親和層析洗脫液的pH至3.3～3.8，進行病毒滅活，(3)調節pH至中性深層過濾，(4)陰離子交換層析，(5)陽離子交換層析。通過該方法可使得目的蛋白SEC純度達到99.6％。CN105263947A公開了一種單克隆抗體的純化工藝，包括離心過濾和深層過濾隨后再調節進行細胞分離和凈化培養物上清液，親和層析，低pH溫育，中和再調節，疏水層析，超濾-滲濾，陰離子交換柱層析，納濾、超濾、滲濾、微濾等過程；其中的抗體包括抗CD20抗體。該方法用到的疏水層析需要高濃度鹽上樣，鹽濃度太高容易影響蛋白的結構活性，使得目的蛋白變性或沉淀，同時無法考慮酸堿異構體的去除。針對現有工藝中經過親和層析獲得的抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體含有多種雜質，影響其藥效及臨床用藥安全，很有必要提供一種步驟簡單且蛋白純化效果更好的抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體的純化方法。

發明內容

為了克服現有技術的缺陷，本發明提供一種離子交換法純化抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體的方法，發明人經過研究，發現采用陽離子層析和陰離子層析相結合，并優化了層析條件，可有效去除抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體中的微量雜質，從而提高了抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體的質量和穩定性。本發明的技術方案如下：

一種離子交換層析純化抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體的方法，包括以下步驟：

(1)對親和層析獲得的樣品加入添加劑，調節pH5.0～6.0；

(2)對步驟(1)得到的樣品進行陽離子層析；