[發明專利]聯合檢測CA19-9與CEA的時間分辨熒光免疫層析試紙條及試劑盒

在審

• 申請號: 201810135356.4
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108132347A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發明（設計）人: 王云龍;米亞雙;李玉林;王繼創;程蕾
• 申請（專利權）人: 河南省生物工程技術研究中心有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/558;G01N33/577;G01N33/574;G01N33/68
• 代理公司: 鄭州銘晟知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 41134
• 代理人: 李靜雅

本發明涉及一種聯合檢測CA19?9與CEA的時間分辨熒光免疫層析試紙條，所述試紙條包括底板、硝酸纖維素膜、玻璃纖維棉和吸水紙，在所述硝酸纖維素膜上包被有CA19?9單克隆抗體作為檢測1線（T1線）、CEA單克隆抗體作為檢測2線（T2線）、以及羊抗鼠多克隆抗體作為質控線（C線），在所述玻璃纖維棉上分為點樣區和結合區，在所述結合區上噴涂有時間分辨熒光微球標記的CA19?9單克隆抗體復合物、CEA單克隆抗體復合物。本發明針對CA19?9與CEA聯合檢測的時間分辨熒光免疫層析試紙條及試劑盒，能夠實現在較短時間內完成對CA19?9與CEA的濃度檢測，檢測結果準確度高、靈敏性好，能夠滿足臨床床旁快速檢測和基層社區醫院的需要。

技術領域

本發明屬于診斷試劑盒技術領域，具體涉及一種聯合檢測腫瘤標志物糖鏈抗原19-9與癌胚抗原的時間分辨熒光免疫層析試紙條、包含所述試紙條的試劑盒，以及它們在胰腺癌診斷中的應用。

背景技術

糖鏈抗原19-9（Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）是一種由消化系統腫瘤組織所產生的特異性糖蛋白，也被稱為唾液酸化的Lewis^a抗原。CA19-9屬于消化系統相關抗原，主要表達于胰腺上皮細胞，正常人體血清中的含量小于37 U/ml。研究表明，CA19-9在消化系統惡性腫瘤患者體內有異常表達，其中，在胰腺癌、膽道癌、胃癌、結腸癌、食管癌、肝癌中存在較高的陽性率，而胰腺癌患者中CA19-9的陽性率最高，達到86-96%，并且在胰腺癌初期，血清中CA19-9的含量達到406 U/ml，CA19-9可作為胰腺癌重要的早期診斷指標之一。

癌胚抗原（CEA）是一種人胚胎原性酸性蛋白，在正常人的血液中含量小于3.4ng/mL，其含量的異常升高與腫瘤細胞的增殖密切相關。CEA是一種廣譜性腫瘤標志物，在目前已經廣泛應用于臨床中腫瘤的檢測診斷。

血清中CA19-9與CEA對于胰腺癌的診斷具有一定的價值，單獨檢測CA19-9與CEA時，對于胰腺癌的確診率較低，而當兩者聯合檢測時對于胰腺癌的診斷顯著提高，幾乎為100%。因此CA19-9與CEA聯合檢測胰腺癌時敏感性高、特異性強，檢測方便，對于胰腺癌的早期診斷具有顯著意義。

目前，國內針對CA19-9與CEA的檢測方法有放射免疫測定法、化學發光法、電化學發光法、酶聯免疫法等，然而，這些方法需要在實驗室借助設備進行，均不適宜用于床旁快速診斷。熒光快速層析檢測技術具有安全、費用低、操作簡便、可實現床旁快速檢測等優點，其中，時間分辨熒光免疫層析無放射性污染、無背景熒光干擾，其原理為：利用時間分辨熒光微球的熒光強度實現對待測物的定量分析。以硝酸纖維素膜為固相載體，待測液為流動相，在吸水紙的吸引下，流動相在硝酸纖維素膜的虹吸作用下與固定在硝酸纖維素膜上的抗體結合形成免疫復合物，形成檢測線。待測物的含量與檢測線的熒光強度呈現一定的關系，通過檢測熒光信號，實現對待測物的定量檢測。該方法作為POCT發展的新方向之一，成為目前的研究熱點，在臨床檢測中具有廣闊的發展前景。基于此，本發明研究開發出針對CA19-9與CEA聯合檢測的時間分辨熒光免疫層析試紙條及試劑盒，能夠實現在較短時間內完成對CA19-9與CEA的濃度檢測，檢測結果準確度高、靈敏性好，能夠滿足臨床床旁快速檢測和基層社區醫院的需要。

發明內容

為解決上述技術問題，發明人采用小鼠腹腔接種法制備獲得CA19-9單克隆和CEA單克隆抗體，并采用時間分辨熒光層析方法對不同亞型和效價組合的抗體進行配對篩選，獲得了線性范圍寬，R²值最大的配對結果，同時，對熒光微球進行篩選，制備獲得了質量穩定可控的時間分辨熒光微球標記的CA19-9單克隆抗體復合物、CEA單克隆抗體復合物，所制備的試紙條質量穩定，熒光強度高，檢測性能好，為胰腺癌的臨床診斷提供了有效工具。

具體而言，本發明提供了如下技術方案：