[發(fā)明專利]一種鹵代醇脫鹵酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810133923.2
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108048438B
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳小龍;金輝;朱林江;梅光耀;陸躍樂;范永仙;汪海波;林金榮
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江宏元藥業(yè)股份有限公司;浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明公開了一種鹵代醇脫鹵酶突變體及其在合成阿托伐他汀關(guān)鍵中間體(3R,5R)6?腈基?3,5?二羥基己酸叔丁酯中的應(yīng)用，所述鹵代醇脫鹵酶突變體HheC?A氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明提供了的1株鹵代醇脫鹵酶突變體，與野生酶相比，其催化活性提高了22倍，比活力提高了約20倍。將突變體HheC?A用于全細(xì)胞催化D3轉(zhuǎn)化A7的反應(yīng)過程，當(dāng)D3的投料量為50g/L時，9小時內(nèi)D3轉(zhuǎn)化率為92％，A7得率72％。突變體HheC?A催化D3轉(zhuǎn)化為A7的產(chǎn)物得率是野生酶HheC的4.8倍。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種鹵代醇脫鹵酶的突變體及其應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

心腦血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬人，居各種死因首位。2015年國內(nèi)調(diào)血脂類藥物總體市場已超過200億元人民幣，他汀類藥物獨(dú)占鰲頭，國內(nèi)他汀藥物終端零售價市場達(dá)到了151.43億元的規(guī)模，占整個降血脂用藥市場近80％。其中，阿托伐他汀上市近20年的臨床證明，藥物安全性高、不良反應(yīng)小，在降低LDL膽固醇治療方面優(yōu)于其它他汀類藥物。2015年，中國阿托伐他汀總體市場達(dá)到了83.19億元，同比上一年增長了7.97％，并仍呈現(xiàn)逐年上漲的趨勢。

隨著市場競爭的日益加劇以及企業(yè)社會責(zé)任的落實(shí)，阿托伐他丁的生產(chǎn)技術(shù)亟需改進(jìn)和創(chuàng)新，一方面需減少工業(yè)生產(chǎn)對環(huán)境資源的破壞及能源的浪費(fèi)，另一方面可降低企業(yè)成本和患者用藥成本，以提升整個行業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。采用生物催化技術(shù)升級阿托伐他汀藥物關(guān)鍵中間體合成技術(shù)，能夠建立節(jié)能、綠色、高效的新生產(chǎn)工藝。鹵代醇脫鹵酶具有一步轉(zhuǎn)化法替代高能耗和高溶劑用量的化學(xué)合成步驟，具備高效催化的特性，適用于建立低能耗、低成本和環(huán)保的阿托伐他汀側(cè)鏈合成新工藝。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種高效催化合成阿托伐他汀關(guān)鍵中間體(3R,5R)6-腈基-3,5-二羥基己酸叔丁酯(A7)合成的鹵代醇脫鹵酶突變體及其應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種鹵代醇脫鹵酶突變體(HheC-A)，所述鹵代醇脫鹵酶突變體HheC-A氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明所述鹵代醇脫鹵酶突變體HheC-A基因是將源于根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens鹵代醇脫鹵酶HheC(氨基酸序列SEQ ID NO.4)的人工合成基因，進(jìn)行體外定向進(jìn)化后，最終篩選得到的突變體。

本發(fā)明還提供一種所述鹵代醇脫鹵酶突變體的編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還涉及一種所述編碼基因構(gòu)建的重組載體及重組載體轉(zhuǎn)化制備的重組基因工程菌。優(yōu)選以pET28a(+)質(zhì)粒為表達(dá)載體，以大腸桿菌為表達(dá)宿主(大腸桿菌BL21(DE3))。

本發(fā)明還提供一種所述鹵代醇脫鹵酶突變體在合成阿托伐他汀關(guān)鍵中間體(3R,5R)6-腈基-3,5-二羥基己酸叔丁酯中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用以含鹵代醇脫鹵酶突變體編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含濕菌體的發(fā)酵液為反應(yīng)介質(zhì)，以(3R,5S)6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯(D3)為底物構(gòu)成pH 8.0-9.0的反應(yīng)體系，在35℃進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化，獲得(3R,5R)6-腈基-3,5-二羥基己酸叔丁酯(A7)。

進(jìn)一步，所述反應(yīng)體系中，濕菌體用量為10～30g/L發(fā)酵液，所述底物終濃度為50g/L發(fā)酵液。

進(jìn)一步，所述發(fā)酵液按如下方法制備：