[發(fā)明專利]一種重金屬鎘人工抗原的制備方法及NOTA在制備重金屬鎘人工抗原試劑中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810132944.2
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108409853B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金仁耀;郭建軍
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工商大學(xué)
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K1/34;C07K1/107
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧;何碧珩

本發(fā)明公開了一種重金屬鎘人工抗原的制備方法，以2?S?(4?氨基苯）?1，4，7三氮雜環(huán)壬烷?1，4，7?三乙酸（p?NH₂?Bn?NOTA，簡稱NOTA）為螯合劑，將鎘離子螯合劑復(fù)合物與載體蛋白牛血清白蛋白BSA或雞卵清蛋白OVA偶聯(lián)，制備人工抗原，該方法在原來傳統(tǒng)基礎(chǔ)上增加了丙二酸二乙酯處理步驟，提高了偶聯(lián)效率與抗血清效價。本發(fā)明還公開了NOTA在制備重金屬鎘人工抗原試劑中的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于重金屬離子免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重金屬鎘人工抗原的制備方法及NOTA在制備重金屬鎘人工抗原試劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

重金屬污染主要指鉛、鎘、汞、鎳、鉻、砷、鋅、銅等污染物對環(huán)境的污染。重金屬分布廣泛、難以降解，可通過大氣、水、食物鏈進(jìn)入人體，與體內(nèi)蛋白質(zhì)及各種酶發(fā)生作用，使它們失去活性，并在某些器官中富集，如果超過人體所能耐受的限度，會造成人體急性或慢性中毒，具有致癌、致畸及致突變作用，對人體具有很大的危害。因此，加強(qiáng)重金屬在環(huán)境、農(nóng)產(chǎn)品和食品中殘留檢測成為保障重金屬安全的重要手段，而新形勢下檢測新技術(shù)的研究和開發(fā)顯得尤為迫切，但是，不同的重金屬由于其屬性不同，處理的方式也不完全相同。

傳統(tǒng)的重金屬檢測方法主要采用原子吸收光譜分析(Atomic AbsorptionSpectroscopy，AAS)、電感耦合等離子發(fā)射光譜(InductiveLy CoupLedpLasma AtomicEmission Spectroscopy，ICP-AES)、陽極溶出伏安法(Anodic Stripping VoLtammetry，ASV)、色譜法和各種聯(lián)用檢測方法。這些方法雖然能對各種環(huán)境樣品中的重金屬離子進(jìn)行有效分析，但大多需要大型儀器，分析方法成本高，樣品需要經(jīng)過消解，分析時間長，不適于重金屬的現(xiàn)場快速檢測，難以適應(yīng)環(huán)境及市場產(chǎn)品的現(xiàn)場抽查、生產(chǎn)企業(yè)自查及產(chǎn)品進(jìn)出口快速通關(guān)的要求，也不會根據(jù)重金屬的性質(zhì)進(jìn)行有針對性的處理。

免疫學(xué)檢測技術(shù)具有檢測速度快、分析容量大、費(fèi)用低廉、儀器簡單易攜、使用人員技術(shù)要求不高，容易普及和推廣、靈敏度高和選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合現(xiàn)場篩選和大量樣品的快速分析，已成為 21世紀(jì)最具競爭性和挑戰(zhàn)性的檢測分析技術(shù)。以該技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的一系列檢測產(chǎn)品，如ELISA檢測試劑盒、膠體金試紙條、免疫傳感器等已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場樣品和大量樣品的快速檢測。

重金屬離子免疫檢測的關(guān)鍵在于抗重金屬特異性抗體的制備，而特異性抗體制備的關(guān)鍵又在于優(yōu)質(zhì)重金屬免疫原的合成。一方面，由于重金屬離子帶有電荷，能與動物體內(nèi)生物分子發(fā)生強(qiáng)烈的不可逆反應(yīng)，引起動物中毒反應(yīng)；另一方面，重金屬的分子量低，不具有免疫原性，需將它與載體蛋白偶聯(lián)，才能形成完整的免疫原，但是由于重金屬離子直接與蛋白連接，會使蛋白質(zhì)變性，因此，需利用雙功能螯合劑螯合重金屬離子，制備金屬-螯合劑復(fù)合物，將該復(fù)合物再與蛋白偶聯(lián)后制備完全抗原，進(jìn)而免疫動物制備特異性抗體。采取的是一種開環(huán)式的雙功能螯合劑進(jìn)行螯合，后再與載體蛋白偶聯(lián)制備人工抗原進(jìn)行動物免疫和抗體的制備，在此基礎(chǔ)上建立不同的免疫分析技術(shù)和方法。

制備重金屬免疫原的關(guān)鍵在于雙功能螯合劑的選擇，目前常用的雙功能螯合劑主要是乙二胺四乙酸(ethyLenediamie tetraacetic acid， EDTA)或二乙烯三胺五乙酸(diethyLene triamine penLaacetic acid， DTPA)的衍生物及其他具有螯合功能的結(jié)構(gòu)類似物，屬于鏈?zhǔn)介_環(huán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，螯合物是由中心離子和多齒配體結(jié)合而成的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的配合物。例如，EDTA與金屬離子通過羧酸基和氮原子鍵合而形成比絡(luò)合物更穩(wěn)定的金屬-EDTA螯合物，而雙功能螯合劑應(yīng)具有兩個作用，除了能特異性螯合重金屬離子之外，還能與載體蛋白偶聯(lián)，形成免疫原，用于后續(xù)免疫動物、制備抗體。這些常規(guī)的螯合劑由于是開環(huán)式和直鏈型的結(jié)構(gòu)，重金屬離子和螯合劑的復(fù)合物作為抗原識別位點(diǎn)在空間結(jié)構(gòu)上比較簡單，特征官能團(tuán)特征不強(qiáng)，導(dǎo)致所制備的抗原決定簇抗原特性不強(qiáng)，直接影響高特異性和高靈敏度抗體的制備效率。

發(fā)明內(nèi)容