[發明專利]大腸桿菌O157:H7單個活菌的快速檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201810131451.7
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108362629B
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 隋志偉;劉思淵;王晶
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N1/34;G01N33/577
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

一種大腸桿菌O157:H7單個活菌快速靈敏定量檢測方法及檢測試劑盒。采用增菌、富集和純化等前處理方法將大腸桿菌O157:H7進行富集純化，然后采用特異性免疫熒光抗體標記大腸桿菌O157:H7，并輔以膜選擇通透性熒光染料來標記區分死菌和活菌，再進行流式分析技術檢測，通過計數不同熒光信號，直接獲得大腸桿菌O157:H7活菌的濃度。本發明的檢測方法具有準確定量、特異性強、靈敏度高、檢測時間短、操作簡便、可區分死活菌的優點。

技術領域：

本發明屬于食品微生物檢測領域，涉及大腸桿菌O157:H7的快速定量檢測，特別是單個活菌的快速檢測方法及試劑盒。

背景技術：

大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一種重要的食源性致病菌，屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，是腸出血性大腸桿菌中最具代表性的血清型。它的感染劑量非常低，最低10個活菌就可能感染致病，主要引起人的出血性腹瀉和腸炎，且并發溶血性尿毒綜合癥、血栓性血小板減少性紫癜等，嚴重的可致人死亡。因此能夠快速準確的定量檢測出食品和水中大腸桿菌O157:H7活菌，對食品安全和保障人民健康具有非常重要的意義。

傳統培養法檢測大腸桿菌O157:H7耗時費力，需要18小時以上時間才能完成檢測。

現有的大腸桿菌O157:H7的快速檢測技術存在以下缺點：

1、不能區分死菌和活菌

眾所周知，只有活菌才有致病性，因此如果不清楚活菌量，即使是定量檢測，也很難估計該菌的感染程度。

但目前國內外主流技術，包括免疫學方法、分子生物學方法、液相芯片法和流式計數法等。不僅檢測時間仍然較長，而且難以區分死活菌。

因為，免疫學方法是通過抗原抗體相互反應的原理，它只能檢測總的細菌抗原蛋白；而分子生物學方法是通過基因擴增原理，只能檢測總的細菌核酸；液相芯片法是通過抗體捕獲細菌抗原再通過抗體標記抗原進行檢測，只能檢測得出細菌表面抗原濃度；先前建立的流式計數法只能通過抗體捕獲細菌，再通過細菌核酸染料進行標記，只能檢測得到總的細菌濃度。以上方法均不能區分死菌和活菌。

2、檢測靈敏度低于該菌的最低感染劑量(10CFU)，更不能檢出單個活菌

大腸桿菌O157:H7的最低感染劑量是10CFU，現有液相芯片法和流式計數法的檢測限都在10³CFU/mL以上，無法滿足大腸桿菌O157:H7檢測的基本需要。

比如，中國專利CN201611201541.6，用流式細胞術快速檢測大腸桿菌O157:H7。操作步驟是將大腸桿菌O157:H7(E.coli O157:H7)用SybrGreen I原液進行染色后，再用B細胞捕獲不同濃度大腸桿菌O157:H7，通過流式細胞儀檢測對應的熒光強度，建立回歸方程，然后每次按照操作步驟檢測得到B細胞捕獲的待測大腸桿菌的熒光強度后，通過程計算得到大腸桿菌O157:H7濃度。

但是，該方法檢測到的大腸桿菌O157:H7是死菌和活菌的總濃度。此外，該專利的檢測限是4.9×10⁴CFU/mL。如果只是單個菌落，無法檢出。

又如，中國專利CN201110360550.0，公開了一種液相芯片檢測大腸桿菌O157的方法

未采用流式分析，利用液相芯片，也不能區分死菌和活菌；而且得到的檢測結果不是絕對定量方法，是相對定量。

另外，CN201110360550.0方法的檢測限是10³CFU/mL。而該菌的最低感染劑量是10CFU。所以，此方法很難實際應用。

因此，快速檢測，靈敏度高(檢測限達到單個菌)，且能檢出活菌數，是大腸桿菌O157:H7檢測的實際需要，也是技術難點。

發明內容：