[發(fā)明專利]用于檢測大豆DNA的特異性引物和探針及實時熒光定量PCR試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810130628.1
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN108103234A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張鐳;徐紅;劉宇琴;車團結(jié);沈頌東;陳游;石文;李亞鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州百源基因技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京中恒高博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11249
• 代理人: 呂玉博

本發(fā)明提供用于檢測大豆DNA的特異性引物和探針，所述探針序列為：5’?AACCCTATCCTCACCCACTCG?3’；所述特異性引物為下述序列或為下述序列的互補鏈序列：上游引物序列為5’?CGATGTGGTCGATTTGAAGA?3’；下游引物序列為5’?AAAGCACGTCATGCGATTC?3’。本發(fā)明還提供相應(yīng)的實時熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明的特異性引物和探針以及相應(yīng)試劑盒能夠用于大豆DNA的實時熒光定量PCR檢測，且所建立的方法具有高敏感性和高特異性，能夠從花生、胡麻、玉米、大豆、土豆、芝麻、油菜、核桃、葵花、橄欖等多種油料作物中特異性鑒別大豆DNA。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測大豆DNA的特異性引物和探針以及實時熒光定量PCR試劑盒。

背景技術(shù)

檢測食用油DNA質(zhì)量的基因主要有葉綠體ATP、RBCL基因和物種特異性基因。葉綠體是植物細(xì)胞重要的細(xì)胞器，葉綠體DNA被廣泛用于系統(tǒng)進化的研究。葉綠體基因具有高度的保守型，而其中rbcL基因正是由于其進化特點而被廣泛用于植物系統(tǒng)發(fā)生的研究。它的一些編碼區(qū)在進化過程中速率較慢，比較保守，而一些非編碼區(qū)在不同的物種間進化速度卻比較快，具有一定的種間差異性和種內(nèi)保守性，因而適合進行物種鑒別。通過對rbcL基因上一段序列進行通用引物設(shè)計，可以對不同的物種同時進行擴增，且同時具有種間差異性，在不同的物種之間差異比較大，易于進行物種鑒別。葉綠體基因在多數(shù)植物中以多拷貝形式存在，所以對于DNA含量甚微的精煉食用油，比單拷貝或少拷貝的物種特異性基因具有更高靈敏度的優(yōu)勢。物種特異性參照基因需要滿足以下2個條件：該作物所有品種都存在該基因；其他生物沒有或不存在擴增該基因的特異靶序列。通過建立物種特異性PCR方法來檢測食品加工品中的該物種，逐漸成為食品質(zhì)量檢測的重要手段。

實時熒光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR)技術(shù)從常規(guī)PCR定性檢測邁上量化的臺階，它相對常規(guī)PCR技術(shù)先進、操作簡便、利用實時熒光定量PCR技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)實時監(jiān)測、絕對定量和快速檢測的目的，同時具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等優(yōu)點，因此非常適合臨床檢測。

實時熒光定量PCR技術(shù)有很多分支，其定量方式也不同，主要分為熒光染料嵌入技術(shù)、熒光探針技術(shù)和自身淬滅熒光技術(shù)等。熒光染料嵌入技術(shù)是利用SYBR green I嵌入DNA雙鏈?zhǔn)菬晒鈴姸仍黾拥奶匦?，將熒光信號引入雙鏈DNA，該方法特異性較差，結(jié)果常受到引物二聚體的存在的干擾而導(dǎo)致假陽性等問題，因此不適合用于食品快檢。而熒光探針技術(shù)如Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)等因為其特異性比熒光染料嵌入技術(shù)和自身淬滅熒光技術(shù)要好，因此更適合食品檢驗使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于設(shè)計一組大豆DNA的特異性引物和探針序列，建立一種能廣泛應(yīng)用于食品檢驗的快速、靈敏、特異性好的用熒光定量PCR檢測方法。本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)，將大豆的Lectin基因片段插入到載體pMD18-T中，獲得含有LectinDNA基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)大豆的LectinDNA的基因片段編碼基因序列設(shè)計并合成一組特異性引物和探針，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立以實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)為平臺的檢測方法，并對所建立的方法進行評估。

針對目前市場上頻繁出現(xiàn)的食用油摻假行為，本發(fā)明以常見的油料作物大豆為研究對象，結(jié)合常規(guī)PCR、實時熒光PCR，研究建立油料作物大豆和食用大豆油的實時熒光探針PCR方法，旨在構(gòu)建快速、簡便、準(zhǔn)確和高效的常見食用油摻假分子生物學(xué)鑒別技術(shù)體系，為食用油質(zhì)量監(jiān)管和控制提供科學(xué)手段。運用分子生物學(xué)技術(shù)對食用油進行摻假檢測，首要前提是從油脂中提取出適合PCR擴增的DNA。由于精煉食用油生產(chǎn)需經(jīng)過高溫及高壓等處理，其中的DNA降解為大小不一的碎片，且含量極低，這給DNA提取造成了很大困難。因而DNA提取技術(shù)成為食用油PCR檢測技術(shù)的瓶頸，是食用油檢測成功與否的關(guān)鍵所在。本發(fā)明采用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，開展食用油品種鑒別技術(shù)研究，將為食用油產(chǎn)品的質(zhì)量安全管理提供科學(xué)手段，有利于國內(nèi)食用油市場的規(guī)范、高端食用油進出口貿(mào)易的順利進行和整個食用油行業(yè)的健康發(fā)展。