[發明專利]一種基于miRNA搭橋對兩個互不重疊的擴增引物進行雙向延伸檢測miRNA的方法

有效

• 申請號: 201810130379.6
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN108179176B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 李先強;姜昕
• 申請（專利權）人: 斯格特生物
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發明公開了一種基于miRNA搭橋對兩個互不重疊的擴增引物進行雙向延伸檢測miRNA的方法，屬于醫學生物技術領域。本發明在檢測miRNA時有兩條引物：擴增引物1與miRNA的3’端一半的序列互補，含T7啟動子和標簽序列；擴增引物2與miRNA的5’端一半的序列相同，含標簽序列。在逆轉錄酶作用下依托miRNA搭橋可實現兩條擴增引物的雙向延伸，形成一個含有標簽序列、miRNA、T7啟動子的dsDNA分子。該分子在T7聚合酶的作用下轉錄出含有標簽序列及miRNA的RNA分子，可根據標簽分子對其進行定性分析。本方法具有高特異、高靈敏和高通量的特點，為以miRNA作為生物標志物的疾病診斷提供技術可能。

技術領域

本發明涉及核酸分子檢測領域，具體涉及一種基于miRNA搭橋對兩個互不重疊的核苷酸片段進行雙向延伸檢測miRNA的方法及試劑盒。

背景技術

miRNAs在基因表達調控中非常重要，高達30％的哺乳動物的遺傳基因的表達都有miRNAs的調控。到目前為止，在人類基因組中已發現超過1000種的miRNAs。成熟的miRNA是一類自然發生的、小的非編碼RNA分子，其中許多miRNA分子僅僅只有一個或幾個核苷酸的不同。miRNAs的表達具有組織特異性，且豐富度不同，具有幾個數量級的差別。更重要的是，miRNA被認為在人類疾病的診斷中是最具潛力的生物標志。

miRNA與普通的RNA相比主要有如下三個特征：(1)miRNAs是很小的分子，約21-25核苷酸長，豐度有相當大的差異；(2)成熟的miRNAs與它們的前體及初前體同時存在；(3)許多miRNAs在序列上高度相關，如它們的不同亞型僅僅只有一個或幾個核苷酸的不同。這些獨特的性質給常規分析帶來挑戰，要么需要繁瑣的分離miRNA的方法，要么特異性不高，無法將不同亞型區分，或者是檢測敏感度低，無法檢測低豐度的miRNAs。

由于miRNA太短，約為20核苷酸，無法直接通過常規引物進行擴增。通常需要在miRNAs末端添加一個尾巴，如poly(A)尾，然后再進行擴增。也可通過使用柄狀環形引物與miRNA的一部分序列形成互補而進行cDNA延伸。這些方法在引物設計和檢測效果上都有一些問題，如引物設計成本高，檢測靈敏度不高，無法區分成熟miRNA和前體miRNA(pre-miRNA)等。

針對上述問題，有必要提供一種不僅能特異性的區分待測miRNA與待測miRNA相似的序列、目標miRNA的前體及同時檢測多種miRNA，而且簡單易行，能快速、高靈敏檢測樣品中miRNA的方法。

發明內容

本發明的目的就是提供一種高特異、高靈敏和高通量的、可同時檢測多種miRNA的方法。

在本發明的第一方面，提供了一種miRNA檢測方法，包括步驟：

(1)擴增引物及穩定序列設計：

a.擴增引物1(命名為oligo1)：oligo1有兩個部分，3’端與待檢測的miRNA一半的序列互補配對，即通過10或11核苷酸長度與miRNA的3’端的半個分子雜交，5’端是T7啟動子序列及標簽序列(命名為ZC1和/或ZC2)，可根據標簽序列ZC1或ZC2設計捕獲探針和檢測探針，用于對后續擴增產物的定性或定量檢測，標簽序列可根據需要進行設計，數量為1-2條，長度為16～20nt左右；T7啟動子序列是T7聚合酶識別位點，用于后續的T7聚合酶轉錄；

b.穩定序列1：為了增加oligo1和待檢測的miRNA雜交體的穩定性，引入穩定序列1，其與標簽序列ZC1和/或ZC2、T7啟動子序列部分互補配對結合；

c.擴增引物2(命名為oligo2)：與oligo1特征相似，有兩個部分，3’端與待檢測的miRNA的5’端序列相同(約10或11核苷酸長度)，與miRNA全長的cDNA序列互補配對結合；5’端含有一個標簽序列ZC3，該標簽序列可以用于后續擴增產物定性檢測時包被探針或檢測探針的設計；