[發明專利]一種無痕跡木霉真菌基因編輯方法

有效

• 申請號: 201810130104.2
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN108384797B
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 沈其榮;繆有志;黃啟為;梅慧玲;夏燕維
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/65;C12N15/90;C12N1/15;C12R1/885
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

1.構建無痕敲除ura3基因的木霉突變體的方法，其特征在于包含：針對ura3基因序列設計四對引物：利用高保真酶擴增，其中，一對引物U3_upF：SEQ ID NO.1和U3_upR：SEQ IDNO.2從木霉基因組上擴增ura3基因上游的1-1.5kb長度的序列，為上游片段；一對引物U3_geneF：SEQ ID NO.7和U3_geneR：SEQ ID NO.8從木霉基因組上擴增上游片段到ura3基因起始密碼子ATG之間的1-1.5kb序列，為ura3基因片段；一對引物U3_downF：SEQ ID NO.3和U3_downR：SEQ ID NO.4從木霉基因組上擴增目的基因終止密碼子下游的500-800bp序列，為下游片段；最后一對引物hygBox_F：SEQ ID NO.5和hygBox_R：SEQ ID NO.6從pcDNA1質粒上擴增潮霉素B磷酸轉移酶基因完整表達框，命名為HygB抗性基因表達框；上述四種不同片段之間通過引物設計使得相鄰兩片段之間具有25bp的末端重合區域，其中，上游片段末端與下游片段起始端重合；下游片段末端與HygB抗性基因表達框起始端重合；HygB抗性基因表達框末端與ura3基因片段起始端重合；通過融合PCR獲得上游片段+下游片段+HygB抗性基因表達框+ ura3基因片段的ura3基因敲除片段；將該ura3基因敲除片段轉化木霉原生質體獲得突變體；在含有HygB的PDA培養基上培養突變體，對能夠在含有HygB的PDA培養上生長的木霉利用菌絲裂解試劑盒進行突變體第一次同源重組驗證，保留發生正確同源重組的突變體菌株，并讓其繼續生長至產孢；將上述發生第一次同源重組的正確突變體的孢子涂布于含有1.5 mg/ml 5-FOA、5 nmol 尿苷的GSM固體培養基上進行培養，發生二次同源重組的片段能夠在含有5-FOA和尿苷的GSM平板上萌發并長出菌塊，挑取陽性突變體并進行純化驗證后得到無痕敲除ura3基因的木霉突變體。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的木霉為含有ura3基因的木霉。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的木霉為貴州木霉NJAU4742。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的融合PCR第一步反應體系中HiFiPremix 10 μl，四種片段各2 μl，ddH₂O 2 μl；反應程序為98℃ 1s，（98℃ 10s，60℃ 7s，72℃ 40s）_15個循環，4℃保存；融合PCR第二步反應體系中HiFi Premix 25 μl，第一步反應產物4μl，U3_upF和U3_geneR引物各2 μl，ddH₂O 17 μl；反應程序為98℃ 1s，（98℃ 10s，60℃7s，72℃ 40s）_30個循環，4℃保存。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的突變體第一次同源重組驗證引物為E_u3F：SEQ ID NO.9和E_hygB_R：SEQ ID NO.10。

6.一種無痕跡木霉真菌基因敲除方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）構建目的基因敲除片段：針對目的基因序列設計四對引物：其中，一對引物擴增目的基因起始密碼子ATG上游的1-1.5kb序列，為上游片段；一對引物擴增目的基因內部的1-1.5kb序列，為基因片段；一對引物擴增目的基因終止密碼子下游的500-800bp序列，為下游片段；最后一對引物擴增貴州木霉的ura3基因完整表達框，全長3598bp，命名為U3表達框；上述四種不同片段之間通過引物設計使得相鄰兩片段之間具有25bp的末端重合區域，其中，上游片段末端與下游片段起始端重合；下游片段末端與U3表達框起始端重合；U3表達框末端與基因片段起始端重合；以木霉基因組為模板，以上述四對引物PCR擴增成功獲得四片段后，通過融合PCR的方法將上述四種片段按上游片段-下游片段-U3表達框-基因片段進行連接，并最終獲得四片段融合產物即為目的基因敲除片段；

（2）目的基因敲除片段轉化權利要求1中所述的無痕敲除ura3基因的木霉突變體原生質體；

（3）通過兩次同源重組篩選獲得目的基因被無痕跡敲除的木霉突變體。