[發(fā)明專利]一種熱穩(wěn)定性高的脂肪酶突變體TDL-mut及其編碼基因有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810127304.2 | 申請日： | 2018-02-08 |
| 公開（公告）號： | CN108359655B | 公開（公告）日： | 2020-04-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 劉丹妮 | 申請（專利權(quán)）人： | 劉丹妮 |
| 主分類號： | C12N9/20 | 分類號： | C12N9/20;C12N15/81;C12N15/55;C12N1/19;C12R1/84 |
| 代理公司： | 廣州科沃園專利代理有限公司 44416 | 代理人： | 孫文卉 |
| 地址： | 519031 廣東省珠海市*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 熱穩(wěn)定性 脂肪酶 突變體 tdl mut 及其 編碼 基因 | ||
1.一種熱穩(wěn)定性高的脂肪酶突變體TDL-mut，其特征在于，編碼其氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熱穩(wěn)定性高的脂肪酶突變體TDL-mut，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熱穩(wěn)定性高的脂肪酶突變體TDL-mut，其特征在于，所述的脂肪酶突變體TDL-mut包含的突變位點(diǎn)為F12C，R42S，G43E，S44N，I45V，I98L，N99A，L100A，K103T，G104E，T231N和K237C。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熱穩(wěn)定性高的脂肪酶突變體TDL-mut，其特征在于，其最適反應(yīng)pH均為8.0，最適反應(yīng)溫度為65℃。
5.一種獲得權(quán)利要求1-4任一所述的熱穩(wěn)定性高的脂肪酶突變體TDL-mut的突變方法，其包括如下步驟：
1)脂肪酶TDL基因合成及克隆：將已公布的脂肪酶TDL基因，按照畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行合成得到合成基因，然后以合成基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的片段克隆到載體pPICzαA上，得到重組載體pPICzαA-tdl；
2)理性定點(diǎn)突變：以pPICzαA-tdl為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果純化回收PCR產(chǎn)物；使用限制性內(nèi)切酶DpnI將純化回收的pPICzαA-tdl質(zhì)粒分解，將分解產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10，通過菌液PCR驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化子，提取驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒進(jìn)行測序，從而確定相應(yīng)的突變體；將測序正確的突變體用SacI線性化，轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的獲得熱穩(wěn)定性高的脂肪酶突變體TDL-mut的突變方法，其特征在于，所述步驟1)中PCR擴(kuò)增引物為：5’端：5'–
AGTCGAATTCTCTCCAGTCAGACGTG AGGTT-3'；3’端：5'-TTCTCTAGATTACAAACAAGTACCAATCAA-3'。
7.一種包含SEQ ID NO：2核苷酸序列的TDL-mut基因。
8.一種包含權(quán)利要求1所述的突變體TDL-mut基因的重組載體。
9.一種包含權(quán)利要求3所述的突變體TDL-mut基因的重組菌株。
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