[發(fā)明專利]一株高產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的解淀粉芽孢桿菌工程菌及發(fā)酵方法

在審

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• 申請日: 2018-02-07
• 公開（公告）號: CN108070548A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 冀志霞;程相錦;陳守文;盧玉
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/12;C12R1/07
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)1?脫氧野尻霉素的解淀粉芽孢桿菌工程菌及發(fā)酵方法，其保藏號為CCTCC NO.M2017849，命名為解淀粉芽孢桿菌HZ?15，并進一步提供了解淀粉芽孢桿菌HZ?15的構(gòu)建方法及高產(chǎn)DNJ的方法。采用分子生物學(xué)技術(shù)，在之前實驗室保存的產(chǎn)DNJ解淀粉芽孢桿菌LX?12的基礎(chǔ)上，通過同源重組方法成功構(gòu)建了高產(chǎn)DNJ的工程菌HZ?15。該菌株以黃豆為原料進行固體發(fā)酵，通過在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1%的麥芽浸粉和2%的乳糖，DNJ產(chǎn)量高達1117.2mg/kg。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的解淀粉芽孢桿菌工程菌及發(fā)酵方法。

背景技術(shù)：

隨著糖尿病患者的日益增加，尋找治療糖尿病的藥物已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大難題。1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin)簡稱DNJ，是一種哌啶類多羥基生物堿，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與葡萄糖類似，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，可以競爭性結(jié)合α-糖苷酶活性部位，當消化道中或糖蛋白加工過程中的糖苷酶被DNJ等多羥基生物堿競爭性抑制時，會出現(xiàn)糖類吸收障礙和糖蛋白寡糖鏈的合成異常等現(xiàn)象，從而具有抑制血糖升高、抗腫瘤、抗病毒等一些生物學(xué)活性。DNJ的來源很廣泛，可通過植物、動物和微生物產(chǎn)生，因微生物具有生長繁殖快，易培養(yǎng)，且可通過菌種改良，發(fā)酵工藝優(yōu)化的方法來提高產(chǎn)量等優(yōu)點，近年來利用微生物合成DNJ已成為研究熱點。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可以合成DNJ的微生物主要有芽孢桿菌和鏈霉菌。

微生物中DNJ的合成途徑相關(guān)研究表明，在芽孢桿菌中，葡萄糖通過異構(gòu)化為果糖，之后經(jīng)氨化、脫磷酸、氧化生成一種氨基糖，氨基糖經(jīng)異構(gòu)化生成甘露伊霉素(MJ)和野尻霉素(NJ)，最終還原生成了DNJ。轉(zhuǎn)氨酶、肌醇磷酸酶和氧化還原酶分別由基因gabT1、yktC1和gutB1編碼，是DNJ合成途徑中的關(guān)鍵酶，這三個基因在解淀粉芽孢桿菌基因組上連在一起，形成調(diào)控DNJ合成的操縱子。然而在DNJ合成過程中，調(diào)控DNJ合成的關(guān)鍵酶不僅上述三種催化反應(yīng)酶，還包括催化MJ轉(zhuǎn)化為NJ的異構(gòu)酶等，而尚未有研究者查找到相關(guān)的調(diào)控基因。目前通過菌株改造的方法來提高DNJ產(chǎn)量的研究相對較少。

目前，已有野生菌發(fā)酵用于DNJ的生產(chǎn)，例如枯草芽孢桿菌B2利用豆渣進行發(fā)酵生產(chǎn)DNJ；解淀粉芽孢桿菌140N以可溶性淀粉為碳源發(fā)酵，其DNJ產(chǎn)量達到0.8g/L；但上述發(fā)酵的產(chǎn)量依然不理想，通過生物技術(shù)手段獲得一株產(chǎn)量高的工程菌，一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員努力的目標。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明提供一株可以高產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的解淀粉芽孢桿菌HZ-15，該菌株于2017年12月28日保存于湖北省武漢市武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO：M2017849。

本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種解淀粉芽孢桿菌HZ-15高產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的發(fā)酵方法，本發(fā)明提供的發(fā)酵方法包括固體發(fā)酵和液體發(fā)酵，兩種發(fā)酵方式均可獲得高濃度的目的產(chǎn)物。

本發(fā)明的最后一個目的在于提供了解淀粉芽孢桿菌工程菌HZ-15在制備DNJ中的應(yīng)用。

為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一株可以高產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的解淀粉芽孢桿菌工程菌HZ-15，所述的菌株通過下述方式構(gòu)建得到：