[發明專利]檢測SA腸毒素SEI的試劑及制備方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201810122691.0
• 申請日: 2018-02-07
• 公開（公告）號: CN108342397A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 喬軍;孟慶玲;孟丹;喬夢凡;伍曄暉;王學領;曹旭東;劉昱成;王國超;田振中;張星星;蔡擴軍;趙春光
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N15/10;G01N33/532;G01N33/577
• 代理公司: 石河子恒智專利商標代理事務所(普通合伙) 65102
• 代理人: 李伯勤

1.一種檢測SA腸毒素SEI的試劑的制備方法，其特征在于主要包含以下過程：

SA的培養及其基因組DNA的提取：將SA接種在LB液體培養基中培養，取對數生長期的SA培養液離心處理，收集菌體，棄上清，菌體用TE緩沖液懸浮后，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取SA基因組DNA，待用；

SA腸毒素SEI基因擴增引物的設計：根據已有SA腸毒素SEI基因序列設計擴增SEI基因序列的特異性引物，在上游引物和下游引物5'端分別引入BamHI和HindIII限制性酶切位點，同時，設計擴增該基因的熒光定量RT-PCR引物，

SA腸毒素SEI基因的擴增與克隆：配制PCR反應體系，該反應體系包括：SA基因組DNA模板，10×PCR buffer，dNTPs，上游引物SEI FP1、下游引物SEI RP1，ddH₂O，Taq DNA聚合酶，將所有試劑加入PCR反應管中并充分混勻，在不同溫度段下進行PCR反應，用1-2％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，將擴增產物電泳后進行回收，與pMD19-T載體連接，轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α，經氨芐青霉素抗性平板篩選及菌液PCR驗證后，獲得重組質粒pT-SEI，

SA腸毒素SEI基因的表達：按照分子克隆的方法，將含有SEI基因片段的重組質粒重組質粒pT-SEI與原核表達pET-28a(+)質粒分別用BamHI和HindIII限制性內切酶進行雙酶切，然后分別回收目的片段和載體片段，用T4DNA連接酶進行過夜連接，并將連接產物轉化入大腸桿菌感受態細胞DH5α中，在含有卡那霉素抗性的LB液體培養基中36-38℃振蕩培養12-24小時，構建pET-SEI重組表達質粒，

按照分子克隆常規方法，將鑒定正確的pET-SEI重組表達質粒轉化入大腸桿菌感受態細胞BL21中，用IPTG誘導培養6-8h，離心收集菌液并加入Lysis Buffer裂解菌體，液氮和40-45℃水浴反復凍融2-5次后進行超聲破碎，每次8-12s，間歇8-12s，80-100次/周期，直至菌液清亮為止，得到SA重組腸毒素SEI，冷凍保存。

2.根據權利要求1所述的檢測SA腸毒素SEI的試劑的制備方法，其特征在于：

SA的培養及其基因組DNA的提取為：將SA接種在LB液體培養基中，36-38℃培養，取對數生長期的SA培養液在5500-6500r/min離心15min。

3.根據權利要求2所述的檢測SA腸毒素SEI的試劑的制備方法，其特征在于：

SA腸毒素SEI基因的擴增與克隆為：配制PCR反應體系，反應體系包括：SA基因組DNA模板、10×PCR buffer、dNTPs、上游引物SEI FP1、下游引物SEI RP1、ddH₂O和Taq DNA聚合酶，將所有試劑加入PCR反應管中，并充分混勻，在不同溫度條件循環反應，得擴增產物，將擴增產物電泳后進行回收，與pMD19-T載體連接，轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α，經氨芐青霉素抗性平板篩選及菌液PCR驗證后，獲得重組質粒pT-SEI。

4.一種檢測SA腸毒素的試劑，其特征在于：根據權利要求1-3任一項所述的方法制備得到SA重組腸毒素SEI。

5.一種檢測SA腸毒素的試劑盒，其特征在于：包含免疫層析試紙條，所述的免疫層析試紙條包含加樣墊、結合墊、NC膜，吸收墊和PVC塑料墊5個部分組成，在NC膜上設置檢測線和質控線，

結合墊制作：取一片NC膜，在該NC膜上均勻滴加制備好的膠體金標記抗SA腸毒素SEI單克隆抗體IgG，在真空干燥箱中36-38℃干燥8-12min，作為結合墊，

在設有檢測線和質控線的NC膜的檢測線上包被經PBS緩沖液稀釋至1-3mg/mL的SA重組腸毒素SEI，在質控線上包被1-3mg/mL的羊抗鼠IgG，常溫下干燥25-35min，

組裝的順序依次為：在PVC板的中間區域貼上NC膜，結合墊貼在NC膜的前方區域；結合墊壓NC膜1-3mm，再在結合墊的前方貼上樣品墊，樣品墊壓結合墊1-3mm，最后將吸水墊在NC膜的后方，吸水墊壓NC膜1-3mm，用試紙條切割刀切成條狀，低溫儲存備用；

所述膠體金標記抗SA腸毒素SEI單克隆抗體IgG為：膠體金溶液與抗SA腸毒素SEI單克隆抗體之比為按體積比為1：4-1：6的溶液，所述膠體金溶液顆粒直徑為20-100nm，與抗SA腸毒素SEI單克隆抗體混合后，在3-5℃恒溫下緩慢振蕩20-40min，12000-14000r/min離心3--50min，棄去上清液，沉淀物溶解于0.05-0.15moL/L、pH＝7.9-8.1的Tris-HCL緩沖溶液中備用。