[發明專利]一種利拉魯肽中間體多肽的制備方法

有效

• 申請號: 201810119330.0
• 申請日: 2018-02-06
• 公開（公告）號: CN108191981B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 潘尚書;湯傳根;李宬;劉曉銳;崔懷言;陳松;張昊寧
• 申請（專利權）人: 美藥星（南京）制藥有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21
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本發明屬于多肽制備方法技術領域，特別涉及一種利拉魯肽中間體多肽GLP?1(7?37)的制備方法。其主要步驟包括構建重組利拉魯肽工程菌，通過大腸桿菌誘導以包涵體形式表達利拉魯肽中間體融合蛋白，再經過變性、復性、酶切和分離純化得到利拉魯肽中間體多肽GLP?1(7?37)。此發明通過改變重組序列信號肽，表達方式變為胞內不溶性包涵體表達，表達量大大增加；洗滌后的包涵體采用堿溶，無需使用大量的變性劑，以蛋白濃度為20?30g/L的高濃度加入包涵體溶解緩沖液，變復性時間不超過1h，溶解后既可以酶切；減少了工序，縮小操作體積，降低試劑成本，利于工業化放大；采用UniSP?50XS陽離子交換分離純化，分離度高。本發明制備的利拉魯肽中間體多肽純度達到87％以上，收率大于85％。

技術領域

本發明涉及多肽制備方法技術領域，具體涉及一種利拉魯肽中間體多肽的制備方法。

背景技術

糖尿病是由于遺傳和環境因素相互作用，引起胰島素絕對或相對分泌不足以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低，引起蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂綜合征，其中以高血糖為主要標志。臨床典型病例可出現多尿、多飲、多食、消瘦等表現，即“三多一少”癥狀。而近年來，隨著生活水平的提高，飲食結構變化，大多數人動少坐多等因素，導致全球糖尿病發病率增長迅速。其中，1型糖尿病患者占10％，2型糖尿病患者占90％。

利拉魯肽(Liraglutide)是一種通過基因重組技術生產的GLP-1類似物，與人GLP-1具有97％的序列同源性，與天然的GLP-1不同的是，利拉魯肽在人體中的藥代動力學和藥效動力學特性更適用于每天1次的給藥方案。皮下注射給藥后，其主要通過如下機理延長作用時間：一是通過自聯作用使吸收減慢，二是與白蛋白結合，三是對DPP-Ⅳ和NEP具有更高的酶穩定性，從而具有較長的血漿半衰期。在2型糖尿病患者中，單次給予利拉魯肽可以觀察到胰島素分泌率以葡萄糖濃度依賴的模式增加。目前國內利拉魯肽完全依賴進口，價格昂貴，因此迫切需要提供一種利拉魯肽的制備方法，為廣大糖尿病患者帶來福音。

利拉魯肽作為胰高血糖素肽(GLP-1)類似物的代表藥物之一，在美國和歐洲地區，它作為2型糖尿病患者經二甲雙胍單藥或其他抗糖尿病口服藥物治療失敗后的二三線藥物使用。2013年版中國2型糖尿病防治指南中規定將胰高血糖素(GLP-1)類似物作為三線治療藥物使用。利拉魯肽的多個臨床試驗研究已經證明聯合不同的口服降糖藥可以有效控制血糖，并能夠使患者減輕體重、減少收縮壓及改善胰島β細胞功能。

利拉魯肽結構式如下：

NH₂-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH

由以上結構式可知：利拉魯肽分子式為C₁₇₂H₂₆₅N₄₃O₅₁，分子量為3751.20，是在天然GLP-1分子結構上將第34位的賴氨酸Lys改為精氨酸Arg，并在26位增加了1條16碳棕櫚脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六?；?))側鏈而得到的衍生物。

利拉魯肽最早由諾和諾德公司開發研制，通過基因重組技術，利用酵母生產獲得?，F有技術中中間體多肽GLP-1(7-37)的合成方法主要采用化學合成，如專利CN104045706B公開了使用多種大量有機溶劑，對于環境不友好，且步驟繁瑣不利于大規模工業放大；工藝雜質多；總收率僅18％。

另外涉及生物制備方法的專利CN104745597A中公開了表達方式為胞內可溶性表達，表達量較低，不利于工業化放大。專利CN104592381A中公開了包涵體溶解耗時過長，體積過大，使用大量的尿素；包涵體需要長時間復性并且復性蛋白濃度0.2g/L，復性所需體積過大，不利于工業放大。