[發(fā)明專利]一種毛白楊胚囊的分離方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810114732.1
• 申請日: 2018-02-06
• 公開（公告）號: CN108486036B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發(fā)明（設計）人: 崔彬彬;魏俊杰;張妍;曹柳青;朱維紅;王晨;湯飛飛;孫宇涵;沈一嵐
• 申請（專利權）人: 保定學院
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 宜昌市慧宜專利商標代理事務所(特殊普通合伙) 42226
• 代理人: 彭婭

1.一種毛白楊胚囊的分離方法，其特征在于，分離方法步驟如下：

（1）取材，取毛白楊雌花序中部開花未授粉、授粉后1-2d的小花；

（2）胚珠的收集與酶解，去掉毛白楊雌花的苞片，在解剖鏡下從子房中剝出胚珠，置于混合酶液中，振蕩、酶解1-3h后，在Olympus CKX41倒置顯微鏡下觀察胚珠酶解過程，在不含酶液的分離液中分離出胚囊，所述的混合酶液成分包括質量濃度1%牛血清白蛋白、10%甘露醇(W/V) 、0.1%果膠酶，0.5%纖維素酶、0.5%半纖維素酶；

（3）染色與透明，對分離出的胚珠和胚囊進行染色或透明處理，所述的染色處理的染色液為1–2%醋酸洋紅；透明處理是將毛白楊花序用卡諾固定液常溫固定24h后，放于質量濃度為70-80%的酒精中保存；再依次用質量濃度為40-60%、20-30%，0%的酒精溶液沖洗；加入0.5-2M氫氧化鈉溶液50-70℃處理30min，冷卻后用清水沖洗；剖開蒴果取出胚珠放入質量濃度為5-15%次氯酸鈉溶液中真空浸透1-2h。

2.根據權利要求1所述的毛白楊胚囊的分離方法，其特征在于，所述的胚珠的收集是用尖頭鑷子去掉雌花的苞片、花盤后，取部分雌花放于培養(yǎng)皿中，然后，在解剖鏡下用解剖針固定住子房，再用解剖針從子房的上端向下劃破，露出里面的胚珠，將胚珠從子房中挑取出來，即可得到胚珠。

3.根據權利要求2所述的毛白楊胚囊的分離方法，其特征在于，將得到的胚珠迅速轉移至混合酶液中，用微量移液器每30min吹打20-30次，使酶液浸沒胚珠，并置于10-20℃酶解2-3h，酶解后用微量移液器反復吹打，然后移至分離液中，在倒置顯微鏡下用解剖針將胚珠外周松散細胞剝去得到珠心，撥開珠心得到胚囊。

4.一種長壽花的分離方法，其特征在于，分離方法步驟如下：

（1）采集開花前2天到開花后1周的花，去除花瓣、花柄和花萼后，露出子房,用解剖針取出胚珠，備用；

（2）胚珠的酶解過程，將得到的胚珠迅速轉移至混合酶液中，并用吸管吹打，使酶液浸沒胚珠，然后酶液于25-28℃，160-170r/min下震蕩1.5-2h，震蕩酶解后用微量移液器反復吹打，然后移至分離液中，在倒置顯微鏡下用解剖針將胚珠外周松散細胞剝去得到珠心，撥開珠心得到胚囊，所述的混合酶液成分包括質量濃度1%牛血清白蛋白、10%甘露醇(W/V) 、0.1%果膠酶，0.5%纖維素酶、1.0%半纖維素酶；

（3）透明處理，是將長壽花花期胚珠置于卡諾固定液中，每3小時換一次液，固定20-30小時后轉入體積濃度為 70%乙醇中，放入冰箱4℃保存?zhèn)溆茫辉儆梦芪悠酚谛∑恐校謩e在質量濃度為30%、50%、70%、90%乙醇中脫水，每次脫水1-2小時后在無水乙醇中脫水12小時以上，最后將樣品在84消毒液中透明半小時，完成長壽花的分離。