[發明專利]鑒定小麥ms1b隱性不育基因的PCR引物對和引物對組合及其檢測方法

在審

• 申請號: 201810110738.1
• 申請日: 2018-02-05
• 公開（公告）號: CN108342502A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 李中安;李敏;周彥;傅仕敏;宋震;阮仁武
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 鄒曉艷

1.一種鑒定小麥ms1b隱性不育基因的PCR引物對和引物對組合，其特征在于：所述的PCR引物對為P1或者P2；所述的引物對組合為P1與P3組合使用，或者P2與P3組合使用；所述引物對P1、P2、P3的序列為：

P1-F：5'-ACCCTCTCTAGATATATCCGT-3'，

P1-R：5'-CATATTCAAGTGTCCCGTCA-3'，

P2-F：5'-GCTATCGTTTCTGTCCGCTCGTA-3'，

P2-R：5'-CCGCTTGACGTGAGTTCCAT-3'，

P3-F：5'-TGAGCGAACAACCTAAGACGA-3'，

P3-R：5'-CCGTGTCAGCTCAATTACCAT-3'。

2.一種鑒定小麥ms1b隱性不育基因的PCR檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)提取待檢測的小麥種子或植株的根莖葉總基因組DNA作為PCR擴增模板；

2)采用權利要求1所述的引物對或者引物對組合對得到的DNA模板進行擴增，根據條帶的有無和強弱判斷待測對象是否含有ms1b隱性不育基因：當采用引物對P1進行檢測時，如果擴增出720bp的條帶，條帶強時則說明檢測對象不含ms1b隱性不育基因，條帶弱時說明檢測對象含有1個ms1b隱性不育基因；沒有條帶時則說明檢測對象含有1對ms1b隱性不育基因；

當采用引物對P2進行檢測時，如果擴增出531bp的條帶，條帶強時則說明檢測對象不含ms1b隱性不育基因，條帶弱時說明檢測對象含有1個ms1b隱性不育基因，沒有條帶時則說明檢測對象含有1對ms1b隱性不育基因；

當采用P1與P3組合雙重PCR時，如果擴增出976bp的條帶，說明檢測對象中含有4B染色體；如果同時擴增出720bp的條帶，條帶強時說明檢測對象不含ms1b隱性不育基因，條帶弱時說明檢測對象含有1個ms1b隱性不育基因，沒有條帶時則說明檢測對象含有1對ms1b隱性不育基因；如果未擴增出976bp的條帶，則說明該樣品檢測結果不準確需要重新實驗；

當采用P2與P3組合雙重PCR時，如果擴增出976bp的條帶，說明檢測對象中含有4B染色體；如果同時擴增出531bp的條帶，條帶強時說明檢測對象不含ms1b隱性不育基因，條帶弱時說明檢測對象含有1個ms1b隱性不育基因；沒有條帶時則說明檢測對象含有1對ms1b隱性不育基因；如果未擴增出976bp的條帶，則檢測結果不準確需要重新實驗。

3.如權利要求2所述的鑒定小麥ms1b隱性不育基因的PCR檢測方法，其特征在于：當采用引物對P1進行檢測時，20μL的PCR反應體系包含：10μL 2×Green Mix buffer；樣品基因組DNA抽提物1μL；濃度為10μmol/L的P1引物對的上下游引物各0.3μL，蒸餾水補足至20μL；PCR反應程序為：預變性95℃，3min，再經95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，40個循環，最后72℃延伸5min。

4.如權利要求2所述的鑒定小麥ms1b隱性不育基因的PCR檢測方法，其特征在于：當采用引物對P2進行檢測時，20μL的PCR反應體系包含：10μL 2×Green Mix buffer；樣品基因組DNA抽提物1μL；濃度為10μmol/L的P2引物對的上下游引物各0.3μL，蒸餾水補足至20μL；PCR反應程序為：預變性95℃，3min，再經95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，36個循環，最后72℃延伸5min。

5.如權利要求2所述的鑒定小麥ms1b隱性不育基因的PCR檢測方法，其特征在于：當采用引物對P1和P3引物對組合進行檢測時，20μL的PCR反應體系包含：10μL 2×Green Mixbuffer；樣品基因組DNA抽提物1μL；濃度為10μmol/L的P1引物對的上下游引物各0.3μL，濃度為濃度為10μmol/L的P3引物對的上下游引物各0.15μL，蒸餾水補足至20μL；PCR反應程序為：預變性95℃，3min，再經95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，40個循環，最后72℃延伸5min。

6.如權利要求2所述的鑒定小麥ms1b隱性不育基因的PCR檢測方法，其特征在于：當采用引物對P2和P3引物對組合進行檢測時，20μL的PCR反應體系包含：10μL 2×Green Mixbuffer；樣品基因組DNA抽提物1μL；濃度為10μmol/L的P2、P3引物對的上下游引物均各0.3μL，蒸餾水補足至20μL；PCR反應程序為：預變性95℃，3min，再經95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，33個循環，最后72℃延伸5min。