[發明專利]一種用于鑒定茶花品種的方法

在審

• 申請號: 201810110271.0
• 申請日: 2018-02-05
• 公開（公告）號: CN108034758A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發明（設計）人: 范瑤飛
• 申請（專利權）人: 范瑤飛
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于鑒定茶花品種的方法，其特征在于，所述方法包括提取待測山茶花品種組織的基因組DNA作為模板，以分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現600-800bp的特異DNA條帶，則待測山茶花品種為怒江山茶，反之則否。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現712bp的特異DNA條帶，則待測山茶花品種為怒江山茶。

3.根據權利要求1或2任一所述方法，其特征在于，所述山茶花DNA提取包括如下步驟：步驟一、取待檢測山茶花品種新鮮幼嫩葉片2g，迅速放入2mL Eppendorf管中，置于液氮罐中預冷；步驟二、將樣品從液氮罐中取出，放入預冷的研缽中，在研缽中不斷倒入液氮將葉片磨成細粉；步驟三、迅速將研磨好的細粉裝入2mLEppendorf管中，加入900μL 65℃預熱的CTAB提取緩沖液，混勻；步驟四、將Eppendorf管置于55℃水浴中，保溫60min，其間不時顛倒混勻；步驟五、待冷至室溫后，加入500μL氯仿/異戊醇，顛倒混勻至溶液呈乳濁狀，6000rpm離心5min分層；步驟六、用剪去端部約0.5cm的2mL吸頭小心將上層液相轉移至另一Eppendorf管中；步驟七、加入600μL異丙醇，顛倒混勻至有白色絮狀沉淀出現；步驟八、4℃，12000rpm離心10min沉淀DNA，去上清，依次用800μL76%乙醇、0.2mol/L乙酸鈉和1mL 70%乙醇洗滌沉淀；步驟九、沉淀干燥后溶于加有3μL RNaseA的50μL TE中，4℃過夜或直接置于-20℃；步驟十、通過紫外分光光度計將DNA濃度調至1μg/μL，備用，如果在步驟九后溶液顏色過深或明顯混濁應重復步驟八，進行二次抽提，加入2% PVP，PVP對抑制多酚氧化酶和細胞色素氧化酶的活性有很好的效果。

4.根據權利要求2-3任一所述方法，其特征在于，所述PCR檢測的反應液包括10×PCRBuffer 2.5μL，10mmol/L dNTPs 2.5μL，25mmol/L MgCl 22.5μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10mM所述分子特異性標記引物各1μL，20ng/μL模板DNA 3μL，ddH2O補足至25μL；

所述PCR檢測的擴增反應在TC-XP型擴增儀上進行，擴增條件為95℃預變性3min；95℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸2min，共35個循環；最后于72℃補平7min，終止溫度為4℃；

所述分子特異性標記引物為：

引物4-f：5′- tacacagggctaggctatcg-3′

引物4-r：5′- cggctttaagggctagaaaa-3′。