[發明專利]一種滲透脅迫處理提高大花萱草EMS離體誘變率的方法

在審

• 申請號: 201810109647.6
• 申請日: 2018-02-05
• 公開（公告）號: CN108377909A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 楊麗莉;劉化濤;楊睿;閆六英;暢平
• 申請（專利權）人: 山西省農業科學院旱地農業研究中心
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01H1/06
• 代理公司: 北京志霖恒遠知識產權代理事務所(普通合伙) 11435
• 代理人: 申紹中

一種滲透脅迫處理提高大花萱草EMS離體誘變率的方法，目的是提高EMS對大花萱草離體誘變效率；本發明以生長發育正常的1?2cm的大花萱草花蕾為材料，以子房為外植體誘導的愈傷組織接入分化培養基,分化出綠色小芽，成為帶芽愈傷組織；帶芽愈傷組織分化培養10天后、EMS誘變前用高滲透T固體培養基脅迫處理愈傷組織30?60分鐘；取出愈傷組織后直接用濃度為0.75?1.0%（w/v）的EMS半致死劑量處理該愈傷組織塊60分鐘；處理后的愈傷組織接種于分化培養基進行分化培養，獲得再生植株；待再生植株長至1?2cm高時，從愈傷組織上切下轉接進入繼代培養基繼代培養15天；以濃度為40%（v/v）的萱草葉枯病菌毒素半致死劑量為定向選擇壓進行脅迫篩選，獲得抗病突變體植株。

技術領域

本發明涉及一種花木——大花萱草EMS（甲基磺酸乙酯）離體誘導突變體發生的方法，具體為一種利用高滲透固體培養基脅迫處理愈傷組織，提高EMS離體誘變效率的技術方法。

萱草(Hemerocallis hybrida)是百合科(Liliaceae)萱草屬多年生宿根草本。是集食、藥和觀賞為一體的植物品種。近年來國內陸續引進了一些觀賞性大花萱草新品種，其葉似蘭，花如百合。有淡黃、金黃、鵝黃、大紅、粉紅、復色等十幾種花色，艷麗繽紛；花型多姿，有單瓣、重瓣、花瓣反卷，婀娜多姿，具有極高的園林觀賞價值。大花萱草在北方干燥寒冷地區表現出極好的栽培特性：它具有短根狀莖和肉質肥厚的紡錘狀塊根，耐旱性、耐寒性極強，大量用做地被植物，部分替代草坪；它管理粗放，養護成本是草坪草的1/5，是優秀的園林綠地花卉，其優良的耐旱耐寒性和高雅多色的觀賞性受到廣泛的認可。萱草的育種研究十九世紀就在歐美興起。二十世紀以來采用傳統的雜交育種方式，培育出了很多優秀的萱草園藝新品種。至今，園藝品種已多達6萬余種。上世紀50年代到80年代，人們通過雜交育種的方法培育出多花色、皺褶和重瓣的萱草品種。隨后，育種方向開始轉向多倍體育種。隨著四倍體萱草的培育成功，萱草品種得到了極大的豐富，成為品種最豐富的宿根花卉之一。國內萱草育種研究主要集中在雜交親和性、生殖隔離和野生資源的開發利用方面。育種目標重點集中在花色、花型、花香和花期變化方面。育種方式多采用雜交育種和倍性育種方法。隨著植物組織培養技術的不斷完善，利用萱草組織或器官離體培養法結合秋水仙素誘導多倍體的方法使育種效率大大提高。

化學誘變育種是一種人為的利用化學誘變劑誘發植物的遺傳變異，可以有效克服雜交不親和性和生殖隔離的現象，在短時間內獲得有利用價值的突變體材料，再根據育種目標的需要定向篩選獲得新品種并穩定遺傳后用于生產應用。隨著細胞工程技術的快速發展，化學誘變和離體組織培養技術相結合，具有不受大田環境影響周年進行，縮短育種時間、擴大變異譜和提高變異率的優點。甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulfonate，EMS）作為化學誘變劑是通過與核苷酸中的磷酸、嘧啶和嘌呤直接反應來誘發點突變，在很多植物上都獲得了不同類型的突變體，在很多農作物和園林植物的改良上得以應用。羅靜采用0.2%EMS浸泡處理1hrs草莓三種愈傷組織塊，其中以直接產生的愈傷組織誘導效果最佳，產生抗灰霉病突變體。楊媚以香蕉愈傷組織和分化芽為受體，0.5%EMS處理40min，獲得“半致死劑量效應”，通過香蕉枯萎病菌梯度脅迫選擇獲得抗香蕉枯萎病菌毒素的愈傷組織塊和分化芽。蔡海燕等利用EMS的誘變作用處理菊花莖尖，突變群體的表型變異率達到6.31%，誘變效果十分明顯。通過EMS離體誘變的方法誘導突變體的產生是一種育種新途徑。該方法的應用，首先要建立一個高效的組織培養體系，提高EMS的誘變效率。影響愈傷組織培養的因素有很多，在愈傷組織誘導和基因的遺傳轉化方面的研究有報道。劉燕蓉在農桿菌介導柳枝稷遺傳轉化體系中采用了“滲透冷處理+真空+干燥”的處理方法使農桿菌轉化效率提高了約15-20%。陳軍營、廖祥儒采用PEG對小麥預處理對小麥成熟胚愈傷組織的形成具有顯著的促進作用。大花萱草的離體誘變育種及如何采用預處理的方法提高誘變效率的研究均未見報道。本研究是以大花萱草愈傷組織為受體材料，通過在固體培養基中添加滲透調節物甘露醇、山梨醇和高濃度蔗糖進行滲透脅迫預處理的方法，提高EMS誘變率。

發明內容