[發(fā)明專利]含有人巨細(xì)胞病毒UL115基因的重組質(zhì)粒、基因工程菌及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810108136.2
• 申請(qǐng)日: 2018-02-02
• 公開（公告）號(hào): CN108300731A
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賴偉健;海戎;孫旭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/38;C12N1/21;C07K14/045;C07K1/22;C07K16/08;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 劉瑜;蘇運(yùn)貞

本發(fā)明公開了一種含有人巨細(xì)胞病毒UL115基因的重組質(zhì)粒、基因工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明中通過將人巨細(xì)胞病毒的UL115基因插入大腸桿菌克隆表達(dá)載體pET32a中獲得含有人巨細(xì)胞病毒UL115基因的重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入原核表達(dá)工程菌BL21(DE3)中獲得重組質(zhì)粒表達(dá)菌。該菌株可以成功表達(dá)帶有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白。該融合蛋白可以作為抗原進(jìn)行相關(guān)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，為人巨細(xì)胞病毒UL115包膜蛋白多克隆抗體和單克隆抗體制備提供原材料，同時(shí)也開發(fā)HCMV快速診斷試劑盒提供了研發(fā)方向，并且為亞單位疫苗的研制，開發(fā)新型高效的抗人巨細(xì)胞病毒提供了可選材料和新的策略。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種含有人巨細(xì)胞病毒UL115基因的重組質(zhì)粒、基因工程菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，HCMV在人群中廣泛感染，在發(fā)達(dá)國家，較下階層的成人HCMV-IgG陽性率為80％，中上階層40％～60％；而發(fā)展中國家的情況則更為嚴(yán)重，HCMV的感染率達(dá)到95％以上。當(dāng)母親感染HCMV后，病毒可通過胎盤傳播給胎兒，也可以通過產(chǎn)道，母乳進(jìn)行傳播，嬰兒身體的各個(gè)組織器官尚未完全發(fā)育，免疫系統(tǒng)的防御功能較差，因而極易受到HCMV感染的侵害，特別是對(duì)剛出生的嬰兒的危害性是非常巨大的。HCMV對(duì)人類影響如此巨大，在如何預(yù)防與檢測該兩方面是很值得我們?nèi)リP(guān)注的。特別建立針對(duì)HCMV感染的早期檢測方法用于孕婦的篩查，這對(duì)于優(yōu)生優(yōu)育及阻斷HCMV傳播有重要意義，可有效避免病毒激活產(chǎn)生的嚴(yán)重后果。檢測是感染后無法避免要進(jìn)行的工作，預(yù)防疾病比控制疾病相對(duì)更簡單，付出的健康成本也是更低。簡單的理解，人群中未受HCMV感染者存在風(fēng)險(xiǎn)，反復(fù)受感染者也有風(fēng)險(xiǎn)。似乎控制這種已與人體長期適應(yīng)的病毒感染，在于使體內(nèi)病毒量與機(jī)體免疫反應(yīng)平衡在一定水平上。這就提示預(yù)防及控制HCMV感染，不僅對(duì)先天性感染是必要的，對(duì)整體人群的保健都是有意義的。特別免疫功能低下的人群，包括剛出生的免疫系統(tǒng)還沒發(fā)育健全的嬰幼兒，免疫抑制劑患者，還有艾滋病患者。

當(dāng)下研究一種可以對(duì)抗巨細(xì)胞病毒的疫苗是最有希望的一種預(yù)防HCMV感染的策略。無論從健康和經(jīng)濟(jì)效益去考慮，有效病毒疫苗是十分重要的。HCMV結(jié)構(gòu)蛋白由外到內(nèi)分別是：包膜糖蛋白，被膜蛋白和衣殼蛋白。在病毒識(shí)別宿主細(xì)胞膜受體，黏附，進(jìn)入細(xì)胞的過程中，包膜糖蛋白起到很重要作用。包膜糖蛋白是病毒的外衣，直接暴露宿主的免疫系統(tǒng)下，免疫系統(tǒng)可以對(duì)包膜蛋白異原性識(shí)別，亞單位疫苗的研究，包膜蛋白可以說是處于首當(dāng)其沖的地位。

gB蛋白是HCMV包膜的糖蛋白，Song等學(xué)者構(gòu)建gB蛋白重組質(zhì)粒的工程菌，并且成功表達(dá)了人巨細(xì)胞病毒gB蛋白，利用免疫親和層析的方法提純gB蛋白，可使血清陰性的志愿者產(chǎn)生中和抗體；MORRIS等研究人員構(gòu)建AVX601是表達(dá)HCMV gB和pp65-IE1的框內(nèi)融合蛋白的雙組分α病毒復(fù)制子顆粒疫苗。該疫苗耐受性良好，僅具有輕度至中度的局部反應(yīng)原性，在一些受試者中報(bào)道了輕度至中度的全身性反應(yīng)原性。Wussow等學(xué)者研究表明，構(gòu)建重組gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚體復(fù)合物基因重組質(zhì)粒的工程菌，用表達(dá)gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚體復(fù)合物的去免疫獼猴產(chǎn)生的抗體可以部分抵抗獼猴CMV感染；Huadong等研究人員構(gòu)建老鼠CMV gH/gL/gO三聚體復(fù)合物重組質(zhì)粒的工程菌，使用gH/gL/gO三聚體復(fù)合物免疫老鼠后，將MCMV抑制在潛伏期感染，發(fā)現(xiàn)可以完全保護(hù)老鼠免受MCMV感染。

大腸桿菌表達(dá)載體pET32a是一種高表達(dá)的原核表達(dá)載體，將基因插入到載體的多克隆位點(diǎn)，能夠獲得融合表達(dá)蛋白質(zhì)。該質(zhì)粒大小約為5.9kb，用于表達(dá)可溶性，具有活性功能的蛋白。該載體使用T7啟動(dòng)子進(jìn)行高效表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白除了目的蛋白外，還包括109個(gè)氨基酸序列的硫氧還原蛋白(用于檢測)，His標(biāo)簽以及S·Tag標(biāo)簽(用于純化)。pET-32a載體具有N端凝血酶酶切位點(diǎn)，N端腸激酶酶切位點(diǎn)。pET32a，pET32b，pET32c載體的差異主要是在于多克隆位點(diǎn)，其他地方完全一致。pET32a表達(dá)載體帶有氨芐青霉素抗性基因，可以用青霉素作為篩選條件。