[發(fā)明專利]FGFR-Fc融合蛋白及siRNA

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810107513.0
• 申請(qǐng)日: 2018-02-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109320614B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 惠琦;王曉杰;李校堃
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N5/10;C12N15/113;A61K31/7088;A61K38/17;A61P9/00
• 代理公司: 北京康思博達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11426
• 代理人: 范國(guó)鋒;路永斌

本發(fā)明提供了FGFR?Fc融合蛋白和siRNA，用于抑制血管生成和抑制FGFR1蛋白的表達(dá)。該FGFR?Fc融合蛋白和siRNA可用于制備抑制血管生成和抑制FGFR1蛋白的表達(dá)的藥物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)和基因工程領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及FGFR-Fc融合蛋白，其可用于抑制血管生成，另外本發(fā)明涉及siRNA，其可用于抑制FGFR1蛋白的表達(dá)。

背景技術(shù)

中國(guó)專利申請(qǐng)第201110303377.0號(hào)公開(kāi)了特異性bFGF結(jié)合肽，其具有結(jié)合bFGF的能力而同時(shí)沒(méi)有與aFGF和FGF21的結(jié)合活性，其中兩種結(jié)合肽中，效果較差的一種一直沒(méi)有得到重視。

然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該肽的效果還是很不錯(cuò)的，尤其是在抑制血管生成方面。另外，本發(fā)明還在研究中令人意外地發(fā)現(xiàn)了一種siRNA，其可用于抑制FGFR1蛋白的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供了新的FGFR-Fc融合蛋白和siRNA，用于抑制血管生成和抑制FGFR1蛋白的表達(dá)。另外，本發(fā)明還提供了該FGFR-Fc融合蛋白和siRNA的編碼核酸、載體、細(xì)胞、制備方法以及應(yīng)用等。

在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于抑制血管生成的FGFR-Fc融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明第一個(gè)方面所述的FGFR-Fc融合蛋白的核酸。本發(fā)明的核酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，優(yōu)選DNA形式。DNA形式包括重組的DNA和人工合成的cDNA，DNA可以是編碼鏈或模板鏈。通過(guò)常規(guī)技術(shù)，如PCR方法、DNA重組技術(shù)或人工合成的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易獲得本發(fā)明的編碼融合蛋白的核苷酸序列或其片段。事實(shí)上，根據(jù)設(shè)計(jì)的多核苷酸序列，當(dāng)前已經(jīng)能夠通過(guò)商業(yè)渠道規(guī)范地制備出相應(yīng)的DNA。一旦獲得核酸，就可以將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入相應(yīng)的細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)的宿主細(xì)胞進(jìn)行增殖，從中分離得到大量的核苷酸序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸的多核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了載體，其含有本發(fā)明第二個(gè)方面所述的核酸。本文中的術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”、“表達(dá)載體”，有時(shí)僅稱“載體”，在此可以交互替換使用，是指本領(lǐng)域中常用的細(xì)菌質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、動(dòng)物病毒及其它各種病毒載體。本發(fā)明中適用的載體包括但不限于：在細(xì)菌中表達(dá)用的載體(原核表達(dá)載體)、在酵母中表達(dá)用的載體(如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等)、在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒載體、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)用的載體(痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達(dá)用的植物病毒載體以及在哺乳動(dòng)物乳腺中表達(dá)用的各種載體。優(yōu)選表達(dá)載體包含選擇標(biāo)記基因，如細(xì)菌的氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷選擇標(biāo)志，如His，Leu，Trp等；真核細(xì)胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氫葉酸還原酶基因及熒光蛋白標(biāo)記基因等。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體是pN24，其適合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。

在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞含有本發(fā)明第三個(gè)方面所述的載體，或者所述細(xì)胞轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有本發(fā)明第二個(gè)方面所述的核酸。本發(fā)明的細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞，如，細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知如何將載體高效地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，所用方法包括但不限于：氯化鈣法、電穿孔法用于細(xì)菌細(xì)胞，電穿孔法、原生質(zhì)體融合法、脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉淀、電融合法以及顯微注射法。令人驚訝的是，本發(fā)明人從當(dāng)前天文數(shù)字般的宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了鼠骨髓瘤細(xì)胞能夠分泌表達(dá)轉(zhuǎn)染入其中的本發(fā)明的bFGF結(jié)合劑，由此無(wú)需破碎細(xì)胞即可利用相對(duì)雜質(zhì)成分較少的培養(yǎng)上清液直接進(jìn)行純化。因此，本發(fā)明優(yōu)選所述細(xì)胞是轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有本發(fā)明第二個(gè)方面所述的核酸的鼠骨髓瘤細(xì)胞，尤其是NS0細(xì)胞。