[發(fā)明專利]一組基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的川金絲猴EST-SSR引物和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810106809.0
• 申請(qǐng)日: 2018-02-02
• 公開（公告）號(hào): CN108531609B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉學(xué)端;張杜;梁伊麗;胡琪;劉宏偉;郭雪;尹華群;高飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888
• 代理公司: 長(zhǎng)沙市融智專利事務(wù)所(普通合伙) 43114
• 代理人: 袁靖

本發(fā)明公開了一組基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的川金絲猴EST?SSR引物和試劑盒。本發(fā)明提供17對(duì)川金絲猴EST?SSR標(biāo)記引物如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:34所示，這些EST?SSR標(biāo)記在9只川金絲猴個(gè)體中具有多態(tài)性，聯(lián)合使用可鑒定不同的金絲猴個(gè)體，是穩(wěn)定存在的SSR標(biāo)記，可用于川金絲猴種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一組基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的川金絲猴EST-SSR引物及試劑盒，屬于分子生物學(xué)分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite)，又被稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandemrepeats,STRs)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats)，是均勻分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，由2～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，因此微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用非常廣泛。微衛(wèi)星標(biāo)記共顯性的特點(diǎn)使它能夠用于研究等位基因，區(qū)分二倍體(或多倍體)的純合體或雜合體，這是AFLP、RAPD等顯性標(biāo)記所無法做到的。另外，微衛(wèi)星的特異性引物擴(kuò)增具有良好的重復(fù)性和保真性，方便各實(shí)驗(yàn)室間的交流。目前，微衛(wèi)星標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用到基因連鎖與遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究、譜系和發(fā)育研究、疾病檢測(cè)以及品種鑒定、親本分析與個(gè)體、純系檢驗(yàn)上。

SSR標(biāo)記分為基因組SSR標(biāo)記和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR標(biāo)記(EST-SSR)。相比基因組SSR標(biāo)記，EST-SSR標(biāo)記在近緣種屬中保守性更好，效率更高。而且基于表達(dá)數(shù)據(jù)的SSR標(biāo)記是基于某一時(shí)期的基因表達(dá)序列，與基因功能和性狀表型直接相關(guān)，因而有著重要的研究?jī)r(jià)值。

川金絲猴(Rhinopithecus roxellana)，隸屬于靈長(zhǎng)目(Primates)、猴科(Cercopithecidae)、疣猴亞科(Colobinae)、仰鼻猴屬(Rhinopithecus)，系我國(guó)特有種，是我國(guó)I級(jí)重點(diǎn)保護(hù)保護(hù)野生動(dòng)物，被國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟(International Union forConservation of Nature，IUCN)名錄列為易危(IUCN，2011)。目前川金絲猴僅分布于幾個(gè)相互隔離的地區(qū)(四川北部及甘肅南部、陜西秦嶺和湖北神農(nóng)架3個(gè)地區(qū))，研究川金絲猴的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)對(duì)我國(guó)珍稀瀕危種質(zhì)資源的保護(hù)具有十分重要的意義。目前用于穿金絲猴遺傳多樣性檢測(cè)的SSR標(biāo)記多來自于其他近緣靈長(zhǎng)類，但是這種依靠SSR標(biāo)記在同屬或同科物種的轉(zhuǎn)移特性的方法，很容易因?yàn)閭?cè)翼序列的突變而轉(zhuǎn)移失敗。雖然川金絲猴的全基因組測(cè)序雖然已經(jīng)完成，但金絲猴專屬的SSR標(biāo)記作為一種簡(jiǎn)單易行的可用于川金絲猴遺傳多樣性和親緣關(guān)系鑒定的重要方式，目前仍未被開發(fā)出來。開發(fā)一組川金絲猴專屬的SSR標(biāo)記引物和試劑已然迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)目前急需但缺乏川金絲猴專屬SSR標(biāo)記的現(xiàn)狀，本發(fā)明的首要目的是提供了一組基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的開發(fā)川金絲猴EST-SSR標(biāo)記引物。本發(fā)明從基因組的外顯子序列中搜索EST-SSR位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)PCR擴(kuò)增引物，先通過外顯子的ePCR驗(yàn)證，最后利用4個(gè)川金絲猴個(gè)體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行無參組裝得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行ePCR，篩選得到17對(duì)具有多態(tài)性的EST-SSR標(biāo)記及其引物。利用這些EST-SSR標(biāo)記成功在9個(gè)川金絲猴個(gè)體中驗(yàn)證其多態(tài)性。本發(fā)明為研究川金絲猴的遺傳多樣性和親緣關(guān)系提供了一種準(zhǔn)確高效快速的途徑。

一組基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的川金絲猴EST-SSR引物對(duì)，所述引物共有17對(duì)，分別為：

第1對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

第2對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

第3對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

第4對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；