[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于測(cè)定細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A抗體的免疫熒光試劑條及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810104563.3
• 申請(qǐng)日: 2018-02-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108061807A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王毅謙;高玲;陳雷;龍?jiān)气P;邵景東;姜珊;李寒玲;趙曉娜;蘇志同;周萍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68;G01N33/558;G01N33/52
• 代理公司: 南京縱橫知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林;薛海霞

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于測(cè)定細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A抗體的免疫熒光試劑條及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明熒光該試劑條有三個(gè)區(qū)域，分別為：加樣區(qū)、結(jié)合區(qū)、檢測(cè)區(qū)。該試劑條由上而下分別為吸水墊、層析膜、結(jié)合墊、樣品墊。其特征在于，結(jié)合墊上噴膜有標(biāo)記了熒光物質(zhì)CY3的CagA抗原，層析膜上C線包被有抗CagA的單克隆抗體，具有高特異性，可用于檢測(cè)血清中CagA抗體。與熒光分析儀一起使用可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單方便?？捎糜趯?shí)驗(yàn)室檢測(cè)，也可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，檢測(cè)只需要約10min。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A抗體的免疫熒光試劑條及其制備方法和應(yīng)用，用于檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化的病人血清中的細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A抗體的濃度，屬于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是多因素共同作用引起的，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。AS是一種慢性炎癥性疾病，炎性機(jī)制存在于AS病變的整個(gè)過(guò)程，炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)在AS發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過(guò)程中有著重要作用。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)等多種促炎物質(zhì)，如溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸，產(chǎn)生多種致動(dòng)脈粥樣硬化作用，包括內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和內(nèi)皮功能異常，刺激黏附因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

AS主要易感人群有高血壓人群、高血脂人群和大量吸煙人群，另外還有糖尿病、肥胖和遺傳因素等。動(dòng)脈粥樣硬化的癥狀主要取決于血管病變及受累器官的缺血程度。

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori,HP)感染是最常見(jiàn)的胃腸道感染之一,中國(guó)HP感染率為34.52％～80.55％，平均感染率為58.07％。

研究表明60％～80％的HP具有單拷貝的細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白基因 A，產(chǎn)生細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(cytotoxin associated gene A protein, CagA)，CagA使得HP具有較強(qiáng)的致病作用。

越來(lái)越多的表明CagA陽(yáng)性HP感染可能與胃腸外疾病有關(guān)。HP 感染與動(dòng)脈粥樣硬化形成有關(guān)，且只有CagA陽(yáng)性菌株可能和動(dòng)脈粥樣硬化形成有關(guān)。對(duì)于HP感染致動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性心腦血管疾病的機(jī)制，相關(guān)研究提出了一些可能，認(rèn)為HP持續(xù)感染導(dǎo)致了炎癥因子激活和釋放,使脂質(zhì)代謝紊亂促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊形成，CagA直接作用于血管壁引起血管平滑肌增生及局部炎癥反應(yīng)導(dǎo)致內(nèi)皮損傷及功能紊亂。

鑒于此，建立一種有效、快速、簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(CagA)抗體的方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明研究制備了一種特異性高、靈敏度高的抗細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A的抗體，在此基礎(chǔ)上制備了一種用于測(cè)定細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A 的免疫熒光試劑條。

本發(fā)明的目的是提供一種用于測(cè)定細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A抗體的免疫熒光試劑條及其制備方法和應(yīng)用。用于檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化的病人血清中的細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A抗體的濃度。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了熒光免疫層析原理制備了熒光免疫層析試紙條，該試劑條有三個(gè)區(qū)域，分別為：加樣區(qū)、結(jié)合區(qū)、檢測(cè)區(qū)。該試劑條的構(gòu)建是將吸水墊、層析膜、結(jié)合墊、樣品墊由上而下的順序緊密粘合在底板上。熒光物質(zhì)標(biāo)記的抗原復(fù)合物(Cy3-CagA) 平鋪于結(jié)合墊上，層析膜上劃有檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，T 線上包被有兔抗人IgG，C線上包被有抗CagA單抗CA-1。滴于樣品墊上的待檢樣品液在毛細(xì)層析的作用下流動(dòng)至結(jié)合墊上，待檢樣品中的人抗CagA抗體與結(jié)合墊上的熒光抗原(Cy3-CagA)發(fā)生免疫反應(yīng)后形成復(fù)合物，隨后一起遷移到NC膜上，到達(dá)T線時(shí)與T線包被的兔抗人IgG結(jié)合并富集截留于T線處，剩余的未反應(yīng)的熒光抗原與C線包被的抗CagA單抗CA-1結(jié)合并富集截留于C線處，在免疫熒光分析儀中檢測(cè)獲得檢測(cè)結(jié)果。兔抗人IgG為購(gòu)買(mǎi)的商業(yè)化抗體。 T線檢測(cè)病人CagA抗體濃度；C線處，過(guò)量的Cy3-CagA抗原復(fù)合物與鼠單抗(即抗CagA單抗CA-1)特異結(jié)合；CagA抗原的表達(dá)和生產(chǎn)通過(guò)大腸桿菌完成。