[發(fā)明專利]高效率血細(xì)胞重編程同時實現(xiàn)基因編輯的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810104276.2
• 申請日: 2018-02-02
• 公開（公告）號: CN108103027B
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 程濤;張孝兵;溫偉;張健萍;許靜
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/113
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12211
• 代理人: 張會雪

1.一種體外血細(xì)胞重編程同時實現(xiàn)基因編輯的方法，其特征在于：該方法包括：將載體組合通過電轉(zhuǎn)染方式導(dǎo)入血細(xì)胞，重編程血細(xì)胞為iPSC；載體組合為pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)，pEV-MYC(M)、pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)、pEV-SV40LT(SV40LT)及針對目的基因設(shè)計的sgRNA，pDonor；針對每個電轉(zhuǎn)反應(yīng)，其載體用量為：OS 2ug，B 0.5ug，M1ug，Cas9-K 4ug，SV40LT 1ug，針對目的基因設(shè)計的sgRNA 1ug，pDonor 2ug；

所述血細(xì)胞為外周血單個核細(xì)胞；

所述pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)、pEV-MYC(M)、 pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)、pEV-SV40LT(SV40LT)載體的構(gòu)建方法為：

在包含SSFV啟動子，Wpre，PolyA，oriP和EBNA1元件的游離型空載體的基礎(chǔ)上，分別將BCL-XL，c-MYC和SV40LT基因mRNA編碼區(qū)序列利用常規(guī)分子克隆方法插入上述游離型空載體多克隆位點構(gòu)建得到pEV-BCL-XL(B)，pEV-MYC (M)和pEV-SV40LT(SV40LT)載體；將OCT4和SOX2基因mRNA編碼區(qū)序列用 E2A序列：CAG TGT ACT AAT TAT GCT CTC TTG AAA TTGGCT GGA GAT GTT GAG AGC AAC CCA GGT CCC，連接后插入上述游離型空載體構(gòu)建得到pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)，其中核心元件OCT4-E2A-SOX2序列為SEQ ID NO:1所示； 將Cas9和KLF4基因mRNA編碼區(qū)序列用E2A序列連接后插入上述游離型空載體構(gòu)建得到pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)，其中核心元件Cas-E2A-KLF4序列為SEQ ID NO:2 所示；

所述pDonor的制備方法：在sgRNA識別位點上游300-600bp序列為同源左臂序列，下游300-600bp序列為同源右臂序列，同源左臂序列的5’端添加sgRNA的序列，同源右臂序列的3’端添加sgRNA序列，需要基因編輯的序列(KIsequence)在同源左臂序列和同源右臂序列之間，最終在載體上得到sgRNA-LHA-KIsequence-RHA-sgRNA的序列。