[發明專利]兩個楊梅黃酮醇合成酶MrFLSs蛋白及其編碼基因的應用

有效

• 申請號: 201810103624.4
• 申請日: 2018-02-01
• 公開（公告）號: CN108048415B
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 李鮮;邢夢云;曹運琳;任傳宏;解林峰;徐昌杰;孫崇德;陳昆松
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12P17/06;A01H5/02;A01H6/82
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

本發明提供了兩個楊梅黃酮醇合成酶MrFLSs蛋白，來源于楊梅果實的雙加氧酶家族，其氨基酸序列SEQ:NO.18和SEQ:NO.19所示。在楊梅果實發育過程中，MrFLS1基因表達與黃酮醇累積呈正相關關系，MrFLS2則在果實成熟時高表達，與后期黃酮醇含量增加相關。本發明驗證了MrFLS1和MrFLS2基因的功能，原核表達體外驗證表明，MrFLS1和MrFLS2蛋白均可將二氫山奈酚催化生成山奈酚、將二氫槲皮素催化生成槲皮素，且MrFLS2具有較高催化效率；在煙草中過量表達MrFLS1或MrFLS2，轉基因植株的黃酮醇含量均顯著增加。本發明可在工程微生物菌及植物遺傳轉化中的應用。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及重組蛋白和基因工程，具體涉及兩個楊梅黃酮醇合成酶MrFLSs蛋白及其編碼基因的應用。

技術背景

FLS(EC 1.14.11.23)屬于FeⅡ/2-酮戊二酸鹽依賴性雙加氧酶家族，是合成黃酮醇化合物必不可少的關鍵酶之一，在2-酮戊二酸鹽和氧氣存在的條件下，它催化二氫黃酮醇發生去飽和反應，生成黃酮醇、琥珀酸鹽、二氧化碳和水。黃酮醇廣泛存在于植物根、莖、葉、花、果實和種子中，對植物生長發育和抵抗逆境等發揮著重要作用，包括調控生長素轉運、促進側根形成、影響花粉發育、抗紫外線、調節葉片氣孔開度等。FLS基因在轉錄水平上的表達模式與植物黃酮醇的積累密切相關。擬南芥種子萌發過程中，白光照射能引起AtFLS1在不同組織中的差異性表達，并導致黃酮醇不同程度的積累。反義NtFLS后，煙草中無法檢測到黃酮醇，而花粉也不能正常萌發成花粉管。

楊梅(Morella rubra)屬于我國特色水果，具有很好的醫藥學活性，這與其較高的黃酮類化合物含量密不可分，而黃酮醇是楊梅中主要的黃酮類化合物，通常以糖苷衍生物形式存在于液泡中。大量研究報道了黃酮醇抗氧化、抗腫瘤、預防心血管疾病、消炎等醫藥學活性。富含黃酮醇的植物可用于生產保健食品、藥品，具有廣闊的開發應用前景。

鑒別出參與楊梅果實黃酮醇生物合成相關的FLS，對于闡明楊梅果實黃酮醇生物合成機制具有重要意義，為開發工程微生物菌奠定基礎，且可指導研究單一黃酮醇化合物分流機制。

發明內容

本發明的目的是提供兩個楊梅黃酮醇合成酶MrFLSs蛋白，來源于楊梅果實的雙加氧酶家族，是兩個參與楊梅黃酮醇生物合成的關鍵基因MrFLS1和MrFLS2，其氨基酸序列如SEQ:NO.18和SEQ:NO.19所示，其編碼的核苷酸序列如SEQ:NO.1和SEQ:NO.2所示。

本發明的另一個目的是提供所述的兩個楊梅黃酮醇合成酶MrFLSs蛋白在工程微生物菌及植物遺傳轉化中的應用。利用原核表達技術將pET28a-MrFLS1或pET28a-MrFLS2重組質粒轉化BL21(DE3)，誘導出的蛋白均可將二氫山奈酚催化生成山奈酚、將二氫槲皮素催化生成槲皮素；利用基因工程技術獲得高表達MrFLS1或MrFLS2的煙草轉基因植株，相較于野生型，轉基因株系中黃酮醇含量顯著增加。

本發明提供的基因特征如下：

(1)基因表達特征：隨著楊梅果實發育，MrFLS1表達先降后升，與楊梅黃酮醇的變化趨勢一致，MrFLS2則在楊梅果實成熟時高表達，與后期黃酮醇含量增加相關；

(2)基因功能特征：(1)大腸桿菌BL21(DE3)表達PET28a-MrFLS1或PET28a-MrFLS2重組載體，誘導表達出的蛋白均可將二氫山奈酚催化生成山奈酚、將二氫槲皮素催化生成槲皮素，說明MrFLSs編碼的蛋白具有黃酮醇合成酶活性，能夠將二氫黃酮醇轉化為黃酮醇；

(3)利用基因工程技術獲得過表達MrFLS1或MrFLS2的轉基因煙草植株，與野生型相比，轉基因株系花中黃酮醇含量顯著上升。