[發明專利]恒溫實時檢測II型鯉皰疹病毒的RPA試劑盒及其專用引物和探針

在審

• 申請號: 201810102971.5
• 申請日: 2018-02-01
• 公開（公告）號: CN108070678A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 王浩;呂利群;孫萌;許丹;姜有聲;余琳
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 曹莉

本發明公開了恒溫實時檢測II型鯉皰疹病毒的RPA試劑盒及其專用引物和探針，所述RPA專用引物的正向引物序列為CCCAGGAGACCAGCAGACTGTTGAACCCGTAC，反向引物序列為GTATCCGCCTCGTCCATCATAGAGCCGAAACC；探針序列為cactctggcgacgcgtttgtggttgaaccgcca(BHQ1?dt)c(THF)g(FAM?dT)ggaggcttcaaaggc(C3spacer)，在第34個bp位置有一個(BHQ1?dt)基團，在第36bp位置有一個(THF)基團，在38bp位置有一個(FAM?dT)基團，尾部含有一個(C3spacer)修飾。采用包括上述引物和探針的RPA試劑盒可以快速且成功檢測鯉皰疹病毒CyHV?II。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及II型鯉皰疹病毒的檢測技術，具體涉及恒溫實時檢測II型鯉皰疹病毒的RPA試劑盒及其專用引物和探針，及在檢測II型鯉皰疹病毒的應用。

背景技術

皰疹病毒性造血器官壞死病(herpesviral haematopoietic necrosis，HVHN)是金(鯽)魚的一種高致病性病毒病，其病原為II型鯉皰疹病毒(cyprinid herpesvirus 2，CyHV-II)，上述病害頻發給鯽魚養殖業造成了破壞性影響。鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)屬于有囊膜的含雙鏈線性大DNA基因組病毒，核衣殼成六邊形，直徑為175～200nm[1-5]，CyHV-II感染鯽魚可引起其內臟組織、鰓和體表廣泛性出血，導致鯽的死亡率高達90％以上。

CyHV-II常規檢測技術中，LAMP技術反應原理復雜，引物設計繁瑣，并且在引物設計時針對靶標序列所需要的保守區段較為嚴格，反應產物不均一，不利于后期的測序構建克隆，因此沒有得到普遍應用；PCR技術耗時較長，成本較高，而且需要精密溫度循環儀器，嚴重限制PCR技術在現場檢測中的應用。近年來，恒溫核酸擴增技術的出現解決PCR技術的局限性，且更加方便、迅速，是一種快速檢測CyHV-II的可行性技術手段。

重組酶聚合酶擴增技術(recombinase poly-merase amplification，RPA)是恒溫核酸擴增技術的一種，RPA利用T4噬菌體編碼的重組酶蛋白uvs X和uvs Y、單鏈結合蛋白gp32和Bsu DNA聚合酶三種酶在37～42℃對目標片段進行等溫擴增，可以在20～40min完成數十億的DNA拷貝。RPA與熒光定量PCR技術(Real-Time PCR)相結合，RPA技術應用于診斷檢測時，向反應體系中加入特異性的特定類型探針，可以達到實時熒光檢測。進行檢測時應用Twist Amp exo探針，此探針攜帶一個熒光基團和一個熒光淬滅劑，分別與一個胸腺嘧啶結合，中間由一個四氫呋喃(THF)堿基隔開，當此結構完整時，熒光強度低。探針的3'端予以封閉，阻斷以此寡核苷酸序列充當引物進行擴增。當探針與靶序列結合時，連接熒光基團和淬滅基團的THF堿基位點就會被核酸內切酶識別并酶解，下游的淬滅基團被釋放，熒光強度增強；酶切后產生的游3'-OH作為DNA聚合酶的靶點并擴增此探針，熒光強度也會隨著其擴增而增強，檢測時間也大大縮短。

發明內容

為克服現有技術的上述缺陷，本發明的目的在于提供恒溫實時檢測II型鯉皰疹病毒的RPA試劑盒及其專用引物和探針，基于重組酶聚合酶擴增技術(recombinase poly-merase amplification，RPA)與實時定量PCR技術(Real-Time PCR)結合，實現II型鯉皰疹病毒(CyHV-II)的快速檢測。

本發明的上述目的通過以下技術方案實現：

用于恒溫實時檢測II型鯉皰疹病毒的RPA專用引物，是根據II型鯉皰疹病毒目的基因設計的，且所述II型鯉皰疹病毒目的基因序列為：