[發明專利]一種促進氧化葡糖桿菌合成山梨醇脫氫酶及輔酶吡咯喹啉醌的方法

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• 申請號: 201810101909.4
• 申請日: 2018-02-01
• 公開（公告）號: CN108456665A
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 鄭裕國;柯霞;魯陽輝;胡忠策;吳洋
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種促進氧化葡糖桿菌發酵產D?山梨醇脫氫酶及吡咯喹啉醌的方法，所述方法為將氧化葡糖桿菌接種至發酵培養基，在28～32℃、150～180rpm條件下發酵培養6～24h，將發酵液離心，收集濕菌體，獲得含D?山梨醇脫氫酶和吡咯喹啉醌的菌體細胞；本發明促進了輔酶pQQ的合成及單位體積D?山梨醇脫氫酶的酶活，用該方法培養獲得的氧化葡糖桿菌生物轉化合成米格列醇前體6?脫氧?6?氨基(N?羥乙基)?α?L?呋喃山梨糖(6NSL)，產物6NSL的轉化進程增加了21～35％，生物轉化步驟周期由48h縮短至36h。此外，在相同底物濃度下(60g/L)，產物6NSL的累積濃度提高了10g/L以上。

(一)技術領域

本發明涉及發酵工程和生物轉化領域，具體涉及到氧化葡糖桿菌發酵培養及細胞膜D-山梨醇脫氫酶(SLDH)及其輔酶pQQ的制備，以及該菌種生物轉化合成米格列醇中間體6-脫氧-6-氨基(N-羥乙基)-α-L-呋喃山梨糖(6NSL)中的應用。

(二)背景技術

米格列醇[(2R,3R,4R,5S)-2-羥甲基-1-(2-羥乙基)-3,4,5-哌啶三醇，miglitol]是Bayer公司開發的一種降糖藥物，通過抑制小腸黏膜表皮細胞的α-糖苷酶活力來減少糖的吸收，具有安全有效、耐受性良好和毒副作用小等優點。

目前合成米格列醇常用的方法是化學生物組合法，該工藝的關鍵催化步驟需要利用位于氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)細胞膜上D-山梨醇脫氫酶(D-sorbitoldehydrogenase，EC 1.1.99.22)在其輔酶吡咯并喹啉醌(Pyrroloquinoline quinine，pQQ)協同下，對底物N-羥乙基葡萄糖胺進行4位羥基的選擇性不對稱氧化，獲得的中間產物直接耦合化學加氫環化合成米格列醇，最后化學加氫生產米格列醇(圖1)。該方法簡化了生產工藝，提高了產物得率，降低了合成成本。其中生物法催化合成中間體6NSL是生產米格列醇的關鍵步驟，主要分為兩個步驟：第一步，氧化葡糖桿菌的發酵生產高活力的山梨醇脫氫酶；第二步，利用靜息細胞催化N-羥乙基葡萄糖胺合成米格列醇關鍵合成前體6NSL。此外，基于膜山梨醇脫氫酶(SLDH)特定的不完全氧化高效催化特性，氧化葡糖桿菌已被廣泛應用于催化合成二羥基丙酮，維生素C等其他多元醇的選擇性氧化催化合成工藝中。

專利CN 101302549A公開了由山梨醇、酵母抽提物等組成的培養基培養氧化葡糖桿菌制備相應的靜息細胞生產米格列醇的工藝，但酵母抽提物的質量百分比高達2.4％，發酵成本所占比重大。此外，US4806650，US5401645等專利公開了以N-羥乙基葡萄糖胺為底物用化學生物組合法合成米格列醇的生產工藝，但缺乏對發酵過程中直接影響米格列醇生物轉化能力的關鍵參數，如單位體積膜山梨醇脫氫酶活力及其輔酶pQQ含量的測定及監控。本發明根據氧化葡糖桿菌發酵合成膜山梨醇脫氫酶的產酶特性，首次提出谷氨酸鈉的添加及部分替代酵母抽提物能夠有效促進輔酶pQQ的合成，并進一步提高山梨醇脫氫酶的發酵體積酶活，最終有效提高單位發酵體積獲得菌體轉化合成6NSL的時空產率，降低了米格列醇合成的生產成本。此外，應用此發酵培養基配方獲得的高活力氧化葡糖桿菌山梨醇脫氫酶不完全氧化作用不僅僅限于米格列醇的合成，也包括其他多元醇，如二羥基丙酮，維生素C等關鍵手性化合物的催化合成。

(三)發明內容

為了解決發酵生產氧化葡糖桿菌靜息細胞工藝中發酵培養基酵母抽提物所占比重大、成本高的限制因素，本發明根據氧化葡糖桿菌的發酵代謝特征及膜山梨醇脫氫酶及其輔酶pQQ的合成代謝通路，提出了一種廉價高效的發酵培養基，添加少量的谷氨酸鈉部分替代酵母抽提物，在降低發酵成本的同時能夠進一步提高山梨醇脫氫酶的發酵體積酶活，為后續靜息細胞催化合成米格列醇中間體6NSL提供了良好的基礎。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案：