[發(fā)明專利]一種耐受嗜中溫細(xì)菌分解的冷水可溶性凝膠基質(zhì)及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2018-01-31
• 公開（公告）號: CN108456711B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡芷荷;滕昆侖;陳博;張建明;盧勉飛;吳清平;熊爭
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;廣東環(huán)凱生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C08J3/075;C08L5/00;C08L3/02
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 許飛

本發(fā)明公開了一種耐受嗜中溫細(xì)菌分解的冷水可溶性凝膠基質(zhì)及其應(yīng)用。基質(zhì)的凝膠劑為卡拉膠或其改性修飾物中的至少一種，凝膠基質(zhì)中添加有凝膠強(qiáng)度調(diào)整劑、卡拉膠酶抑制劑。本發(fā)明的微生物檢測片，由于選用了不易被嗜中溫細(xì)菌直接分解的冷水凝膠，同時(shí)加入特殊抑制凝膠酶分解的酶抑制劑和凝膠強(qiáng)度調(diào)整劑，保證了微生物的正常生長，避免了不利影響，因而使得含芽孢桿菌的樣品在培養(yǎng)過程中不液化、不擴(kuò)散、單菌落清晰易觀察計(jì)數(shù)。由于形成瓊脂樣有一定凝膠強(qiáng)度的透明凝膠，大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌等培養(yǎng)后形成的菌落邊緣相對更規(guī)則且顏色更明亮，特征與傳統(tǒng)瓊脂培養(yǎng)基接近，更典型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于微生物培養(yǎng)基凝膠基質(zhì)及其應(yīng)用，特別涉及一種耐受嗜中溫細(xì)菌分解的冷水可溶性凝膠基質(zhì)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

通常菌落總數(shù)計(jì)數(shù)使用傾注法、表面涂布法、螺旋接種法或膜過濾法，所有這些方法都無一例外的使用瓊脂培養(yǎng)基和玻璃或塑料的培養(yǎng)皿。瓊脂是一種從石花菜等紅紫色海洋藻類中提取的膠質(zhì)。瓊脂最初應(yīng)用于微生物學(xué)是1881年由范尼.赫塞提出。到20世紀(jì)初瓊脂由于在高溫培養(yǎng)某些致病菌過程中仍然保持凝膠強(qiáng)度而開始替代明膠作為凝固劑的首選。瓊脂在常溫下為凝膠狀態(tài)，在高達(dá)65℃條件下依然為堅(jiān)硬的凝膠。瓊脂在大約85℃熔化，而在32～40℃左右開始凝固。細(xì)菌學(xué)的瓊脂需要有良好的透明度、可控的凝固溫度和熔化溫度、良好的擴(kuò)散性、無細(xì)菌抑制毒性及相對缺乏代謝有用的礦物質(zhì)和化合物。瓊脂通常可以抵抗微生物酶的分解，對溫度、離子、pH等因素較穩(wěn)定。瓊脂用于凝固培養(yǎng)基通常終濃度為1～2％。傳統(tǒng)瓊脂培養(yǎng)基需加水煮沸溶解并高壓蒸汽滅菌，冷卻至合適溫度時(shí)使用。已滅菌的瓶裝培養(yǎng)基使用前仍需長時(shí)間水浴或流動蒸汽加熱熔解，然后冷至50℃左右再傾注到多個(gè)梯度的樣品中，充分搖動混勻并冷卻凝固。整個(gè)過程需消耗大量水電資源，并需使用高壓設(shè)備，制備時(shí)間長且過程復(fù)雜，工作效率低。分裝過程需要在高潔凈度的空間環(huán)境，但長時(shí)間的冷卻凝固過程仍易造成污染。

食品等樣品菌落總數(shù)計(jì)數(shù)采用傾注平板法，將高壓蒸汽滅菌并冷至45℃左右的培養(yǎng)基與菌液混勻后傾注無菌平板，較高的溫度對微生物特別是受損傷微生物造成進(jìn)一步損害甚至導(dǎo)致其死亡。表面螺旋接種需要借助螺旋接種儀、劃線、涂布接種需每次灼燒接種環(huán)或換用新的一次性接種環(huán)。在進(jìn)行大量樣本檢測時(shí)，操作極為不便，效率低下。

近幾年來發(fā)展的微生物紙片法以高分子透氣隔水材料為載體，以冷水可溶性凝膠作為凝固劑，為即用型無菌產(chǎn)品，無需培養(yǎng)基的制備，使用簡便，只需加樣、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)三個(gè)步驟，測試程序簡化，可大幅精簡微生物定性定量指標(biāo)測試的流程，并在更短時(shí)間內(nèi)獲得測試的結(jié)果。在不犧牲產(chǎn)品質(zhì)量的情況下使產(chǎn)品快速上架銷售，降低倉儲成本。紙片法可以用來計(jì)數(shù)食品等樣品中的嗜中溫菌落總數(shù)，如3M petrifilm aerobic plate count。

菌落總數(shù)通常是指需氧條件下嗜中溫(30℃或36℃)細(xì)菌在平板計(jì)數(shù)瓊脂上培養(yǎng)48或72h形成的菌落數(shù)。其中芽孢桿菌對外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣泛，普遍存在于水、空氣、土壤中。其生長繁殖迅速，在較短培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)即可產(chǎn)生大量酶使微生物紙片法的紙片發(fā)生液化。所以，當(dāng)食品等樣品含有芽孢類桿菌時(shí)，3M紙片在培養(yǎng)時(shí)會液化，菌落較多時(shí)紅色連成片難以觀察計(jì)數(shù)。

其它梅里埃tempo tvc采用MPN法計(jì)數(shù)，16孔乘3行的卡，三行孔容量分別為225μl、22.5μl、2.25μl，充滿樣液后培養(yǎng)會分解底物產(chǎn)生熒光信號，計(jì)算機(jī)通過讀取信號數(shù)量和位置來計(jì)算最大可能數(shù)。Soleristvc通過菌生長產(chǎn)生CO₂通過防水透氣膜使底部指示劑顏色變化來檢測微生物的污染。Simplate稀釋后加入培養(yǎng)觀察顏色變化孔數(shù)，通過表轉(zhuǎn)換成權(quán)重再乘以稀釋倍數(shù)。這些計(jì)數(shù)方法雖然檢測效果與傳統(tǒng)方法相當(dāng)，但需復(fù)雜的儀器設(shè)備來配套，價(jià)格昂貴，難以在基層推廣使用。

用于微生物培養(yǎng)用的凝膠基質(zhì)，要求對微生物的生長基本無影響。這大大限制了其選擇范圍。同時(shí)，為保證微生物的生長，要求凝膠基質(zhì)強(qiáng)度要適宜，強(qiáng)度過大會抑制微生物的生長，影響檢測結(jié)果；而強(qiáng)度過低，又不利于觀察。