[發明專利]一種高通量檢測活性微生物的pH敏感型熒光傳感器及構建方法

有效

• 申請號: 201810097374.8
• 申請日: 2018-01-31
• 公開（公告）號: CN108254348B
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 范子彥;李中皓;鄧惠敏;楊飛;劉珊珊;邊照陽;王穎;張艷革;唐綱嶺
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

一種高通量檢測活性微生物的pH敏感型熒光傳感器及其構建方法，包括以下步驟：1）熒光納米材料制備，使用乙醇溶解磷脂聚乙二醇和5?(N?十六烷酰)氨基熒光黃，充分混合，緩慢滴入純水中制備熒光納米膠束；2）傳感凝膠制備，在1~3%的熱瓊脂溶液中加入熒光納米膠束充分混合，冷凝制備熒光傳感凝膠；3）傳感器構建，利用水相濾膜將容器分割為兩部分，下部裝入傳感凝膠，上部裝入液體微生物培養基。本發明的優點是將培養單元和檢測單元分開，通過檢測傳感凝膠中熒光信號的變化，實現活性產酸產氣微生物快速、實時檢測，相對傳統平板法，該傳感器基于傳統的培養理論，操作方便，檢測時間短，能夠實現不同材料中微生物的高通量篩選。

技術領域

本發明屬于微生物檢測領域，涉及痕量活性微生物的檢測，具體是一種高通量檢測活性微生物的pH敏感型熒光傳感器及構建方法。

背景技術

近年來，國內外的食品安全事件層出不窮，不僅影響了市場秩序，還給公眾帶來了一定的恐慌，比如近期發生的恒天然奶粉的微生物污染事件，雖然最終證明并非肉毒桿菌，但也間接表明社會對食品中微生物污染的憂慮。

傳統用于微生物檢測的平板計數法，準確性、靈敏性較高，但涉及的實驗較多、操作煩瑣、需要較長時間準備和收尾，而且要有大量人員參與。所以，迫切需要準確、省時、省力和省成本的快速檢驗方法，目前主要在用的方法有微生物測試紙片、生物化學檢測法、ATP法、流式細胞儀等。

3M公司的Perrifilm^TM Plate系列微生物測試片，可分別檢測菌落總數、大腸菌群計數、霉菌和酵母計數等，紙片法與國標法都是基于傳統培養理論，在微生物檢出率上一致性較好，且菌落典型，易判定，但是檢測通量不高，測試紙片的靈敏度仍有進一步提高的需要。

PCR技術采用體外酶促反應合成特異性DNA片段，再通過擴增產物來識別細菌。由于PCR靈敏度高，理論上可以檢出一個細菌的拷貝基因，因此在細菌的檢測中只需短時間增菌甚至不增菌，即可通過PCR進行篩選，節約了大量時間，但PCR技術是需要較高的人員要求和實驗室環境，而且對活菌和死菌無法做到區分，同時復雜基質中靶標基因的提取也有一定的困難。

ATP生物發光法利用ATP生物發光分析技術和體細胞清除技術，測量細菌ATP和體細胞ATP， 細菌ATP的量與細菌數成正比，從而實現微生物的檢測，但是該方法并不能區分出微生物的種類，只能用于微生物總量的監控。

流式細胞術利用標本預處理后，制備單細胞懸浮液，特異性染色后進行分析，分析速度快，可以多參數同時分析，但是儀器昂貴，分析的濃度需要較高的數量級，對痕量微生物分析誤差較大。

綜上所述，目前雖然已有許多微生物檢測的方法與技術，但是大部分都存在一定的問題，而且和傳統的培養理論差別較大，結果一致性上存在風險，痕量微生物的檢測還是存在一定的挑戰。因此，開發一種靈敏度高、操作簡便并且能夠實現對大批量樣品進行快速檢測的方法成為迫切需要解決的問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有痕量微生物檢測技術的不足，發展一種基于實時熒光、操作簡單、靈敏度高、檢測通量高的監測分析技術-高通量檢測活性微生物的pH敏感型熒光傳感器及構建方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種高通量檢測活性微生物的pH敏感型熒光傳感器，包括組裝在專用容器中的傳感凝膠、水相濾膜和液體微生物培養基組成，傳感凝膠與液體微生物培養基通過水相濾膜相隔且傳感凝膠位于容器底部，所述傳感凝膠是由固定在瓊脂凝膠中的熒光納米膠束構成。

所述專用容器為PE材質的帶有封蓋的塑料管，具體結構如圖2所示，由3部分組成，底部為傳感器，中部為微生物培養部分，上部為封蓋，底部可以透過熒光，與中部用水性濾膜進行隔離。

構建方法包括：

1）采用磷脂聚乙二醇和5-(N-十六烷酰)氨基熒光黃溶于乙醇中充分混合，逐步滴入純水中制備熒光納米膠束；