[發明專利]一種深度成像超分辨顯微成像系統

有效

• 申請號: 201810097037.9
• 申請日: 2018-01-31
• 公開（公告）號: CN108303806B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 李旸暉;李雨雪;周輝;劉小煜;夏成樑
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: G02B27/58
• 分類號: G02B27/58;G02B26/10;G02B21/36;G01N21/64
• 代理公司: 杭州之江專利事務所(普通合伙) 33216
• 代理人: 黃燕

本發明公開了一種深度成像超分辨顯微系統，包括第一激光器、第一透鏡、第一二色鏡、第二二色鏡、第二激光器、第六透鏡、相位調制組件、第三二色鏡、變形反射鏡、X軸掃描振鏡、相位補償組件、Y軸掃描振鏡、豎直光路折轉匹配單元、第二四分之一波片、顯微物鏡、樣品臺、水平光路折轉匹配單元、第一濾光片、波前傳感器、第二濾光片、第十透鏡、成像器件。該系統利用雙光子效應，利用波前傳感器和變形反射鏡補償熒光波前相位變化，結合樣品臺在Z軸方向的移動，在修正樣品所帶來的像差的同時實現三維深度成像，成像質量更高。

技術領域

本發明涉及光學顯微成像領域，具體涉及一種深度成像超分辨顯微成像系統。

背景技術

在常規的光學顯微成像系統中，由于光學元器件的衍射效應，平行入射的照明光經過顯微物鏡聚焦之后在樣品上所形成的光斑并不是一個理想的點，而是一個具有一定尺寸的衍射光斑，根據阿貝衍射極限公式，可見光能聚焦的最小光斑的直徑約為200nm左右。1994年由德國科學家S.W.Hell首次提出STED超分辨顯微成像技術，它超越了衍射極限，并于2006年實現了30納米的空間分辨率，這一杰出的工作使他在2014年獲得諾貝爾化學獎。

STED超分辨的基本思想是：利用受激輻射效應來減小有效熒光發光面積，一個典型的STED顯微系統中需要兩束光實現上述目的，一束為激發光，另一束為損耗光。當激發光照射熒光樣品時，會激活激發光聚焦光斑內的光的熒光分子，其中的電子將會躍遷到激發態，聚焦光斑為中空圓環形的損耗光與激發光合束后，激發光聚焦光斑和損耗光聚焦光斑的重疊部分激發態的電子以受激輻射的方式回到基態，其它位于損耗光聚焦光斑中空位置的激發態電子由于沒有受到損耗光的影響，繼續以自發輻射的形式向外發生熒光回到基態。由于受激輻射和自發輻射過程中發出熒光的方向和波長不同，因此經過過濾后被探測器所接受的光子均是由位于激發光聚焦光斑中心位置的熒光樣品通過自發熒光的方式產生的。這樣有效熒光的發光面積得以減小，從而提高了系統的空間分辨率。

目前STED超分辨顯微成像系統在生物醫學的應用中，在瀧口優的專利文獻《受激發射損耗顯微鏡裝置，公開號CN106133580A》中雖實現了超分辨，在一定程度上提高成像分辨率，但由于單光子激發受散射影響較大，使得激發光不宜穿透標本且光漂白嚴重等缺陷影響該系統的分辨率，限制了其廣泛應用。

隨著生物醫學的研究發展，研究者對STED超分辨顯微成像系統的分辨率、成像深度要求越來越高。雙光子激發時的波長較長，受散射影響較??；此外焦平面外的熒光分子不被激發，使較多的激發光可以到達焦平面，因此與單光子激發相比，雙光子激發的激發光可以穿透更深的標本且光漂白和光毒性小，適用于三維深度活細胞成像，于是人們開始將雙光子激發技術與STED超分辨顯微成像系統相結合。在S.W.Hell等人的專利文獻《具有雙光子激發的STED熒光顯微技術，公開號CN101821607A》中用雙光子激發代替單光子激發，但由于樣品表面的不平整性和樣品內部折射率分布的不均勻性所帶來的像差導致系統無法實現對深度組織的高分辨率成像，限制了其廣泛應用。

發明內容

本發明針對現有超分辨顯微系統對生物樣品結構實現三維成像時存在的樣品深度方向掃描的像差問題，提出了一種深度成像超分辨顯微系統。該系統利用雙光子效應，結合變形反射鏡補償像差帶來的波前相位變化，修正樣品所帶來的像差，實現三維超分辨成像。

一種深度成像超分辨顯微成像系統，包括第一激光器、第一透鏡、第一二色鏡、第二二色鏡、第二激光器、第六透鏡、相位調制組件、第三二色鏡、變形反射鏡、X軸掃描振鏡、相位補償組件、Y軸掃描振鏡、豎直光路折轉匹配單元、第二四分之一波片、顯微物鏡、樣品臺、水平光路折轉匹配單元、第一濾光片、波前傳感器、第二濾光片、第十透鏡、成像器件；

所述第一激光器輸出的激發光經第一透鏡擴束和第一二色鏡透射后到達第二二色鏡；

所述第二激光器輸出的損耗光經第六透鏡擴束和相位調制組件調相后，到達第二二色鏡，與到達第二二色鏡的激發光重合，形成重合光；