[發(fā)明專利]一種催化活性提高的酸性脂肪酶突變體

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810096248.0
• 申請日: 2018-01-31
• 公開（公告）號: CN108220270A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 喻曉蔚;徐巖
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N1/19;C12N15/81;A61K38/46;A61P1/00;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種催化活性提高的酸性脂肪酶突變體，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的突變酶ATLLid與將218的Val替換成Trp的突變酶ATLV218W的水解活性顯著提高。ATLLid和ATLV218W對對硝基苯酚月桂酸酯p?nitrophenyl laurate(p?NPL)的水解活性分別為2.26和3.86倍，對p?NPL的催化效率k_cat/K_m值較ATL分別提高了3.85倍和9.46倍。與ATL相比，ATLLid和ATLV218W的最適pH也為5.0，并在pH 2.0?10.0具有較好的穩(wěn)定性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種催化活性提高的酸性脂肪酶突變體，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

脂肪酶(EC 3.1.1.3)又稱甘油三酯水解酶，廣泛分布于自然界中，是一類能在油水界面或水不溶系統(tǒng)進(jìn)行酯類水解或酯類合成的界面酶。脂肪酶在工業(yè)上得到了廣泛的應(yīng)用，包括食品、化工、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域，故而對脂肪酶的催化活性提出了更高的要求。多數(shù)脂肪酶的最適作用pH在中偏堿性條件下，然而，研究人員發(fā)現(xiàn)在酸性條件下具有較高催化活性的酸性脂肪酶具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。例如，在醫(yī)藥行業(yè)中，酸性脂肪酶可用于治療胃腸紊亂、消化不良等疾病；在食品行業(yè)中，酸性脂肪酶可在適當(dāng)條件下產(chǎn)生低級脂肪酸等風(fēng)味物質(zhì)，增強(qiáng)食品香味；在飼料行業(yè)中，在幼畜幼禽的飼料中添加脂肪酶可以有效解決幼畜因消化機(jī)能尚未發(fā)育健全，內(nèi)源性脂肪酶分泌量不足而導(dǎo)致的早期斷奶產(chǎn)生的明顯應(yīng)激，避免對消化系統(tǒng)發(fā)育和消化酶分泌產(chǎn)生不良影響，并能提高飼料內(nèi)脂肪類物質(zhì)的利用率。

曲霉屬脂肪酶在酸性環(huán)境中表現(xiàn)出良好的催化活性和耐受性，是獲取高性能酸性脂肪酶重要來源之一。其中對于黑曲霉來源的酸性脂肪酶研究更為廣泛，如，產(chǎn)自黑曲霉Aspergillus niger AN0512的脂肪酶在pH 5.0時催化活性最高，且在pH 3.0-7.0范圍內(nèi)保持良好的穩(wěn)定性；產(chǎn)自A.niger NICM 1207的脂肪酶在pH 2.5和45-50℃條件下水解活力最高，且在pH 2.5-9.0范圍內(nèi)可保持較高活性。然而，黑曲霉來源的酸性脂肪酶多已申請了專利保護(hù)，如生產(chǎn)工藝和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域。因此，亟待開發(fā)其他來源的酸性脂肪酶，為工業(yè)應(yīng)用提供更多的酶源選擇。Shi等人發(fā)現(xiàn)了一種來自土曲霉Aspergillus terreus的酸性脂肪酶ATL，但僅對其進(jìn)行了酶學(xué)特性研究。ATL具有良好的耐酸性能，其最適pH為4.0，且在pH3.0-12.0范圍內(nèi)活力穩(wěn)定。A.terreus發(fā)酵脂肪酶活力僅為13.7U/mL，純酶比活力為24U/mg，催化活性較低。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本文將土曲霉A.terreus來源的酸性脂肪酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在真核外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，通過ATL三維結(jié)構(gòu)模擬及多序列同源比對，利用理性設(shè)計的方法在脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合口袋域選擇關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，以期提高ATL的催化活性。

本發(fā)明的第一個目的是提供脂肪酶突變體，所述突變體是在氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的脂肪酶上，將第92～95位的精氨酸、絲氨酸、脯氨酸和丙氨酸分別替換為絲氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸和賴氨酸。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述脂肪酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將第92～95位的精氨酸、絲氨酸、脯氨酸和丙氨酸分別替換為絲氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸和賴氨酸得到突變體ATLLid。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述脂肪酶突變體的催化活性提高。

本發(fā)明的第二個目的是提供編碼所述脂肪酶突變體的基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明的第三個目的是提供含有所述基因的表達(dá)載體。

本發(fā)明的第四個目的是提供表達(dá)所述脂肪酶突變體的重組菌。